孙强 作品数:22 被引量:61 H指数:3 供职机构: 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 国家科技重大专项 北京市自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 更多>>
一种人肠道病毒C组血清型鉴定引物、检测试剂盒和应用 本发明提供了一种人肠道病毒C组血清型鉴定引物、检测试剂盒和应用,属于涉及生物技术领域。一种人肠道病毒C组血清型鉴定引物,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物EVCY17和核苷酸序列如SEQ ID NO:2... 严冬梅 张勇 孙强 杨倩 冀天娇 宋洋 肖金波埃可病毒11型不同基因型间交叉中和效应及抗原性变异的初步研究 2025年 埃可病毒11型(Echovirus 11,E11)是一种常被检出的肠道病毒,近年来在亚洲与欧洲地区多次报道由E11引发新生儿重症病例甚至导致死亡。自1994年E11在我国被首次检出后,其基因型历经多次更替。为探究基因型更替与型间交叉中和能力是否存在相关性,本研究选取了曾经在中国流行的A1、A2、C1、C3、D5以及E基因型的代表性毒株,依次进行噬斑试验、浓缩、纯化和灭活,随后与铝佐剂混合,于第0周、第2周、第4周,分三次对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。在末次免疫1周后,采集小鼠抗血清进行交叉中和效果评估。中和实验结果表明,不同基因型间的交叉中和能力存在显著差异。部分毒株能够突破前代毒株所形成的免疫保护屏障,这一现象与E11流行基因型转换的规律相契合。其中,D5基因型毒株展现出较高的免疫原性以及较为广谱的交叉保护特性,具备作为理想疫苗候选株的特征。同时,当前流行的D5基因型毒株抗血清对C1和C3基因型毒株提供的交叉保护作用有限,提示未来有可能出现新的基因型更替。此外,通过序列分析发现,VP1-BC loop和VP2-EF loop区域的差异可能对E11毒株的抗原性产生影响,进一步揭示了E11免疫逃逸的潜在机制。本研究系统地探讨了E11的交叉免疫效应及其对基因型更替的影响,为制订E11感染的防控策略和开展疫苗研发提供了重要的参考依据。 刘莹 李冀琛 王蕊 李慧洁 梁钰材 段伟 肖金波 孙强 张勇关键词:肠道病毒 基因分型 肠道病毒D68型流行基因型高灵敏通用型Real-time RT-PCR检测方法建立及应用 2025年 自2014年肠道病毒D组68型(Enterovirus D68,EV-D68)引起急性弛缓性脊髓炎暴发以来,一直被广泛关注。建立一种快速、高效且便捷的EV-D68特异性Real-time RT-PCR检测方法,对于及时发现潜在的传染源并迅速阻断传播至关重要。本研究参考EV-D68各个基因型VP1区代表序列设计探针和引物,通过制作标准品,对其特异性、灵敏度以及重复性进行全面评价,并用临床样本检测其可靠性。结果显示,本研究所设计的探针和引物仅能检出EV-D68,其他73种血清型肠道病毒均无检出情况,最低检测下限为2×10^(1)拷贝/μL,拷贝数与循环阈值之间具有良好的线性关系(R^(2)=0.9933),重复性检测的变异系数小于1.70%,稳定性良好。采用本研究设计的探针和引物对41份临床样本进行检测时,实现了零漏检,与测序的金标准结果完全吻合,对于目前流行的B3和D3基因亚型可以实现全覆盖。综上所述,本研究设计的特异性探针引物在EV-D68检测中展现出高效且准确的特性,同时对目前流行的基因型具有较强的通用性,能够为EV-D68感染的临床诊断、疫情监测以及流行病学调查工作提供有力支持,为EV-D68的快速鉴定和相关疾病防控提供关键技术支撑。 肖梦怡 韩振志 路环环 丛如意 冀天娇 祝双利 孙强 刘莹 周蕾 栗凡 梁钰材 范华 肖金波 张勇关键词:实时荧光定量RT-PCR 单纯疱疹病毒1型引起的发热出疹性疾病需要与手足口病进行鉴别 被引量:5 2013年 对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体。从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HEp-2细胞上进行病毒分离,对病毒分离阳性的标本提取病毒核酸,然后使用荧光定量-逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行人肠道病毒(HEV)核酸的检测。对HEV检测结果阴性的标本采用序列非依赖的单引物扩增技术(SISPA)进行"未知病原体"的鉴定。分离到的6株病毒均鉴定为单纯疱疹病毒I型(HSV-1),结合分析这起流行中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HSV-1是引起这起发热出疹性疾病流行的病原体。6株HSV-1的gG区核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,同源性分别高达98.8%和97.9%,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的。HSV-1等病毒引起的发热出疹性疾病需要与HFMD进行鉴别诊断,由于仅从临床症状和流行病学资料上判断引起发热出疹性疾病的病原体是非常困难的,因此,必须依赖于实验室的诊断。 祝双利 刘建锋 孙强 李静 李晓嫘 张勇 陈瑛 温小云 严冬梅 黄国虹 张宝敏 张波 安洪秋 李慧 许文波关键词:发热出疹性疾病 手足口病 单纯疱疹病毒1型 基于RNA-seq技术研究埃可病毒30型感染RD细胞前后的差异表达基因 被引量:1 2022年 埃可病毒30型(Echovirus 30,E30)是一种全球传播的B组肠道病毒,常与无菌性脑膜炎等疾病暴发有关,分析E30在感染人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma,RD)细胞前后的差异表达基因有助于了解该病毒的复制周期以及宿主感染机制。本研究通过转录组测序技术探究E30感染RD细胞前后的基因表达谱变化,共检测到的1281个差异表达基因,其中包括730个下调基因和551个上调基因。基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,显著差异表达基因主要参与细胞受体信号通路的调节、炎症反应、免疫细胞活化、调控细胞生命周期等。利用荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)对其中9个与炎症和免疫反应相关的差异表达基因进行验证,发现DEAD-box解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3,DDX3)表达上调,这与转录组学分析一致。利用RK-33(DDX3的小分子抑制剂)靶向抑制DDX3的表达,发现RK-33能够抑制E30的复制,并且qPCR结果显示在抑制DDX3的表达后,GTP酶激活蛋白结合蛋白1(GTPase-activating protein-binding protein1,G3BP1)和干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)的表达也出现不同程度地降低。本研究的结果提示DDX3表达可能影响E30复制,这一发现为进一步探索E30在感染宿主过程中的分子机制奠定基础。 李冀琛 张国艳 张珂艺 杨倩 刘志军 孙强 张勇关键词:埃可病毒30型 RNA-SEQ 差异表达基因 一种人肠道病毒A组血清型分型引物及分型方法 本发明涉及一种人肠道病毒A组血清型分型引物及分型方法,所述方法包括使用以下人肠道病毒A组血清型分型引物,EVAY17和EVAZ17,该引物位于人类肠道病毒的VP1核苷酸编码区;本发明进一步包含所述引物的试剂盒。 张勇 孙强 严冬梅 肖金波 祝双利柯萨奇病毒A10型对利巴韦林耐药性的初步研究 2024年 近年来,全国范围内手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)的感染率逐渐上升,其中柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)是主要病原体之一,利巴韦林是临床上治疗儿童手足口病的常用药物之一。为了评价利巴韦林在体外对CVA10的抑制效果,本研究中,我们随机选取了19条2009-2021年的不同地区和不同年代的有代表性的中国内地优势流行基因型C基因型的CVA10毒株,通过细胞毒性实验(Cell counting kit-8,CCK8)来检测利巴韦林在RD细胞上对CVA10的抑制率。将抑制率大于85%的CVA10定义为对利巴韦林敏感组,抑制率小于15%的CVA10定义为对利巴韦林耐药组。结果显示利巴韦林在0.78mmol/L浓度下可以对CVA10产生较好的抑制作用并且对细胞的毒性较低。19株CVA10中有4株表现出对利巴韦林耐药性,2株表现出对利巴韦林敏感性,剩余13株的敏感性在85%~15%之间。通过7日龄ICR乳鼠感染实验比较对利巴韦林敏感组和耐药组毒株的致病力差异,通过观察乳鼠临床评分、生存率、体重及组织取材的滴度测定结果均表明对利巴韦林敏感组CVA10在小鼠上的致病力比耐药组强。进一步使用MEGA 7.0软件对影响CVA10复制和翻译的2C区氨基酸序列进行差异性分析,以分析可能的耐药位点。结果显示对利巴韦林耐药组和敏感组CVA10的2C区的327位和328位氨基酸位点存在差异。本研究发现当前国内流行的CVA10存在广泛对利巴韦林耐药现象,其中部分CVA10对利巴韦林完全耐药。因此,有必要加强对CVA10耐药株的监测,以便更好地指导临床医生正确地选择抗病毒药物,为个体化的治疗提供理论依据。 孙甜甜 宗彦君 王蕊 李冀琛 刘莹 李晓亮 韩振志 于力恒 刘志军 孙强 张勇关键词:利巴韦林 耐药性 柯萨奇病毒A组16型VP1-145位氨基酸变异影响对硫酸乙酰肝素结合能力的初步探究 被引量:1 2024年 柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)与肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是国内导致手足口病的重要病原体,二者同源,来自共同祖先,基因组结构相同,并且均使用硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)作为吸附受体。本研究基于EV-A71的VP1-145位氨基酸位点的相关研究结果,分析CVA16的VP1-145氨基酸差异,选取3株中国流行的,在该位点具有差异的CVA16,进行对HS结合能力影响的研究。使用不同浓度肝素酶Ⅰ处理人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma,RD)细胞,比较不同CVA16株对肝素酶Ⅰ处理前后的RD细胞的吸附能力,以及接种后12h,24h,48h后各毒株在RD细胞的复制情况。结果表明,在使用5mIU/mL和10mIU/mL浓度肝素酶Ⅰ水解RD细胞表面的HS后,VP1-145氨基酸位点为甘氨酸(Glycine,G)的CVA16对RD细胞的吸附能力下降,其下降程度与肝素酶Ⅰ的作用浓度呈正相关,且影响了后续12h,24h,48h病毒在RD细胞中的复制,其差异具有统计学意义(P<0.05)。而VP1-145氨基酸位点为谷氨酸(Glutamic acid,E)的两株CVA16均未观察到此种趋势。为了进一步探究该种结合能力的差异与病毒致病力之间的关系,对三株病毒进行2日龄ICR乳鼠感染实验。通过观察乳鼠生存率、临床评分、体重变化,来评估不同CVA16株在小鼠感染模型中的致病力差异。结果表明,CVA16(VP1-145E)的致病力明显强于CVA16(VP1-145G)。后对三株病毒进行全基因组测序,测序结果显示,除VP1-145位点外,三株CVA16还存在其他的差异位点,故后续我们又通过反向遗传学拯救病毒,对VP1-145位点的作用机制进行了进一步的探讨。本研究结果证实,VP1-145位点的氨基酸变异会影响CVA16与HS的结合能力,145位点为E的病毒,其与HS的结合能力较差,当145位点由E突变至G时,病毒与HS的结合能力增强,其与RD细胞的结合能力受到肝素酶Ⅰ的影响。本研究为CVA16毒力位点与致病机制的研究提供了一定的理论基础 宗彦君 孙甜甜 王蕊 刘莹 李冀琛 孙强 刘志军 张勇关键词:柯萨奇病毒A组16型 硫酸乙酰肝素 致病力 干扰素诱导跨膜蛋白3对流感疫苗免疫反应的影响 被引量:2 2020年 干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)的单核苷酸突变位点(Singlenucleotide polymorphism,SNP)rs12252-C在中国人群的比例高,与流感病毒H1N1/09感染后疾病的严重性相关。本文主要探索流感病毒三价灭活疫苗(Trivalent inactivated vaccine,TIV)免疫IFITM3敲除小鼠后机体免疫反应的变化。采用转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术构建IFITM3敲除小鼠模型,TIV肌肉注射免疫小鼠,使用流式细胞术检测小鼠脾脏的获得性免疫细胞,如T细胞、B细胞,以及固有免疫细胞,如自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK细胞)、树突状细胞(Dendritic cell,DC)、巨噬细胞(Macrophage,Mф)、中性粒细胞等的数量变化情况。TIV免疫后7d,IFIMT3敲除小鼠脾脏CD8^+T细胞、NK细胞的数量和活化水平升高,生发中心(Germinal center,GC)的B细胞数量下降,CD4^+T细胞、DC、Mф、中性粒细胞的数量没有显著变化。本研究提示,IFITM3敲除影响了TIV免疫后小鼠脾脏免疫细胞的数量和活化水平,为IFITM3与免疫反应的关系研究奠定了基础。 雷娜 雷娜 鲁健 孙强 郭俊峰 周剑芳 郭俊峰 李梓 秦堃 孙灵利关键词:流感病毒 免疫反应 甲型流感病毒感染野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结的转录组学研究 被引量:3 2020年 干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)敲除小鼠(Ifitm3^-/^-小鼠)感染流感病毒后,表现出更为严重的病理损伤和死亡率。最近的研究发现,IFITM3蛋白表达也会影响机体针对流感病毒的适应性免疫反应效果。由于空间效应,纵膈淋巴结在机体抵抗流感病毒急性期感染的适应性免疫应答过程中发挥重要功能,本研究欲探究使用流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/H1N1进行感染后,野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结中与免疫相关的差异表达基因。本研究对流感病毒PR8感染后第3d的纵膈淋巴结进行RNA-Seq测序。高通量测序共检测到有1312个差异表达基因,其中上调和下调差异表达基因分别为904和408个。这些差异表达基因主要参与炎症反应与细胞凋亡信号通路、T细胞和B细胞受体信号通路、T细胞和B细胞激活与细胞因子分泌等信号通路。采用荧光定量PCR对部分免疫相关的差异表达基因进行验证,结果与RNA-Seq测序结果一致。本研究为进一步阐明IFITM3在适应性免疫应答中拮抗流感病毒的分子机制奠定了基础。 孙强 孙强 鲁健 鲁健 刘淑慧 舒跃龙关键词:流感病毒 纵膈淋巴结 RNA-SEQ