以甘油光学清除的小鼠皮肤为研究对象,通过二次谐波(second-harmonic generation,SHG)成像和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)研究光学清除对组织超微结构的影响.SHG成像结果表明,甘油处理能够显著增大信号强度并提升成像深度,证实其可作为一种有效的光学清除剂.通过TEM对比观察常规化学固定与高压冷冻(high-pressure freezing,HPF)固定样品的超微结构,发现HPF能更好地保持组织自然状态.进一步分析显示,甘油处理虽使胶原纤维直径减小,但其排列周期未发生明显变化,说明光学清除过程未对胶原纤维结构造成损伤.上述结果表明,甘油具有高效、安全的光学清除效果,且在光学清除过程中不会引起组织超微结构的改变.结合SHG无损光学成像技术与HPF的超微结构保留能力,可为相关科学研究提供技术支撑.
激光共聚焦同步双扫描(simultaneous,SIM)技术在常规扫描单元的基础上,引入一个同步扫描单元(SIM scanner),该技术独立控制了两个激光束,一个用于激光光刺激,另一个用于同步成像。本实验中,采用激光共聚焦同步双扫描系统的405 nm和488 nm激光分别对细胞的特定部位进行刺激和同步成像,实时检测了LC3复合物的形成,记录并分析了乙酰化前后LC3的光动力学变化过程,证实了LC3的脱乙酰化修饰是自噬性降解所必须的,本实验体系为激光共聚焦双扫描技术的推广提供了一个很好的平台。SIM技术的应用,解决了刺激过程无法成像的问题,为漂白后荧光恢复(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)、漂白后荧光损失(fluorescence loss in photobleaching,FLIP)和光诱导激活等研究提供了最佳的解决方案,可作为光刺激的一种实验模式在很多实验设计中进行延伸应用。
