陈尧
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- PRPS1 I72位点突变对急性淋巴细胞白血病耐药性的影响及其机制研究
- 2023年
- 目的·研究磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)I72位点突变是否能使急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)细胞对巯嘌呤类化学治疗(化疗)药物6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)产生耐药性,并解释其作用机制。方法·将临床上已发现的PRPS1基因的各突变(I72F、R177S、V316L)和2个ALL细胞系(KOPN72bi和RS4;11)中存在的PRPS1基因突变(V208A、V289A)分别插入融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的载体pGV303中,用已证明的对巯嘌呤类化疗药耐药的PRPS1 A190T突变为阳性对照,对该类药不耐药的空载体pGV303(Vector)、PRPS1野生型(wild type,WT)及PRPS1 I72V突变为阴性对照。将上述构建好的载体瞬时转染入HEK-293T细胞(简称293T细胞)中,并采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测PRPS1各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况。采用药物敏感性实验检测并计算6-MP或6-TG对上述瞬转PRPS1各突变体的293T细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))。随后,除PRPS1 I72F和I72V之外,将第72位异亮氨酸(isoleucine,I)变成其他氨基酸的多个突变即I72M、I72L、I72N、I72S、I72T分别插入载体pGV303中,瞬时转染入293T细胞后采用Western blotting、药物敏感性实验检测各突变体在293T细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50)。采用慢病毒感染法将PRPS1 WT、I72F、I72V、A190T及载体pGV303感染REH细胞系,通过流式细胞术分选GFP阳性细胞以获得PRPS1各突变体稳定表达的细胞,并采用Western blotting及药物敏感性实验检测各突变体在REH细胞中的蛋白表达情况以及6-MP或6-TG的IC_(50),用以验证293T细胞获得的药物敏感性实验结果。采用AnnexinⅤ/DAPI双染法评估各REH细胞系的凋亡情况,并通过Western blotting检测各REH细胞系的DNA损伤相关蛋白[S139位点磷酸化的组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX-S139
- 崔芷嫣陈尧陶悦陶悦李慧
- 关键词：急性淋巴细胞白血病巯嘌呤
- 甲氨蝶呤可逆转PRPS1基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤的耐药性被引量：4
- 2016年
- 目的 :探讨甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是否可以逆转磷酸核糖焦磷酸合成酶1(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1,PRPS1)基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)的耐药性,并初步探讨其可能的作用机制。方法 :将携带野生型(wide type,WT)PRPS1基因以及A190T或S103T突变型PRPS1基因的重组慢病毒分别感染人急性淋巴细胞白血病Reh细胞以感染空载体GV303作为空白对照),采用细胞活力实验和蛋白质印迹法验证上述细胞系构建成功。分别用MTX和6-MP单药以及MTX+6-MP联合用药处理各细胞系,然后锥虫蓝拒染法和AnnexinⅤ/7-AAD双染法分别检测细胞的增殖和凋亡情况;蛋白质印迹法检测DNA损伤相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平;细胞活力实验和液相色谱-质谱联用法分别检测MTX作用各细胞系后,6-MP对细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)、6-MP代谢产物以及次黄嘌呤水平的改变。结果:外源性PRPS1蛋白在Reh细胞中成功过表达,而且与对照组GV303和WT细胞系相比,感染PRPS1突变基因的A190T和S103T细胞系均对6-MP和MTX耐药,差异均具有统计学意义(P值均<0.001)。与MTX和6-MP单药组相比,MTX+6-MP联合用药可以更有效地抑制A190T和S103T细胞的增殖(P值均<0.001),促进细胞凋亡(P<0.01,P<0.001),上调磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)、磷酸化细胞周期检验点激酶(2phosphorylated checkpoint kinase 2,p-Chk2)及聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]剪切体的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。此外,MTX处理各细胞后,6-MP对A190T和S103T细胞的IC50值远远低于MTX未处理组P值均<0.001),且细胞中次黄嘌呤的水平明显降低(P值均<0.001),而6-MP的代谢产物硫代次黄嘌呤核苷酸(thioinosine monophosphate,TIMP)和硫代鸟嘌呤核苷酸(thioguanosine monophosphate,TGMP)的水平均明显升高(P值均<0.001)。结论 :MTX可以逆转PRPS1�
- 吴同敏李慧方后顺陈尧周斌兵
- 关键词：甲氨蝶呤
- 叶酸代谢与儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的研究进展
- 2020年
- 随着医疗技术的提高与新型药物的研发,儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的治愈率显著提高,但是一旦出现耐药或复发,长期生存率则会较低并发生预后不良。因此,耐药复发是儿童ALL治疗的瓶颈,也是导致治疗失败和死亡的首要因素。叶酸拮抗剂类药物是ALL常用的化学治疗药物之一,旨在特异性阻断叶酸代谢途径中的各种酶,从而显著减少叶酸储存并扰乱核苷酸的生物合成,诱导快速分裂的细胞凋亡。本文总结了叶酸拮抗剂类药物治疗中产生耐药的主要机制,以期为克服其耐药提供新的思路和策略,进一步减少儿童ALL患者的复发比例,提高治愈率。
- 王树轩许岩陈尧方后顺李慧
- 关键词：急性淋巴细胞白血病叶酸代谢叶酸拮抗剂耐药
