段有文
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：沈阳医学院奉天医院更多>>
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- 新型人骨形成蛋白2逆转录病毒载体的构建及活性检测
- 2008年
- 目的构建表达重组人骨形成蛋白2（BMP2）基因的重组逆转录病毒，对其在成骨细胞中的生物学作用进行探讨。方法克隆BMP2基因，与pDNR-CMV连接构成pDNR-CMV-BMP2，然后将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和逆转录病毒质粒pip-LNCX以loxP位点进行同源重组，构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2，转染包装细胞PT67进行病毒包装，NIH3T3细胞测定病毒滴度；将逆转录病毒感染人成骨细胞，噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长变化，Westernblot检测BMP2蛋白表达。结果重组逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2经鉴定连接正确；病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后，上清液中病毒滴度可达到5×10^8pfu；MTT检测见逆转录病毒组与对照组比，48和72h细胞抑制率（5．1％比5．3％，8．5％比8．3％）差异无统计学意义（P〉0．05），转染48h后Westernb lot可见BMP2蛋白高表达。结论成功构建了BMP2逆转录病毒，为BMP2基因治疗及其功能研究提供了有效的手段。
- 段有文赤人杰陈晓春关景玉白宏治常洪涛
- 关键词：骨形成蛋白2逆转录病毒成骨细胞蛋白表达
- 新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测被引量：1
- 2010年
- 背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道。目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用。方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48h后Westernblotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒SalI和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72h细胞抑制率无明显差别(P>0.05),转染48h后Westernblotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达。结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体。
- 廖青唐颖赤仁杰陈晓春关景玉段有文
- 关键词：反转录病毒成骨细胞四甲基偶氮唑盐蛋白表达
