丁鹏
- 作品数：5 被引量：50H指数：5
- 供职机构：郧阳医学院附属人民医院更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 融合蛋白PEP-1-SOD1预处理对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞保护作用的实验研究被引量：9
- 2007年
- 目的构建原核表达载体 pET15b-PEP-1-SOD1,观察表达的融合蛋白 PEP-1-SOD1能否转导入人脐静脉内皮细胞,以及转导的 PEP-1-SOD1融合蛋白能否减轻人脐静脉内皮细胞的缺氧/复氧损伤。方法构建原核表达载体 pET15b-SOD1和 pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化基因工程菌 BL21(DE3),表达出 N 端带有6个组氨酸"标签"的 SOD1和 PEP-1-SOD1融合蛋白。将纯化后的融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察这种融合蛋白的转导能力及其在细胞内的活性。采用体外培养的人脐静脉内皮细胞建立缺氧/复氧损伤模型,检测不同浓度的 PEP-1-SOD1对氧化应激损伤的人脐静脉内皮细胞的生存率、乳酸脱氢酶和丙二醛含量的影响。结果 PEP-1-SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,并表现出剂量依赖性和时间依赖性的特点,2μmol/L PEP-1-SOD1-30 min 组 SOD1酶活性为(60.88±6.73)U/ml,显著高于对照组酶活性(41.06±4.19)U/ml,P<0.01,转导入细胞内的 PEP-1-SOD1融合蛋白的活性可以维持至24 h。PEP-1-SOD1各浓度组均提高缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞的生存率,减少乳酸脱氢酶的释放量,降低丙二醛含量。结论 PEP-1-SOD1融合蛋白能直接以天然有活性的形式转导入人脐静脉内皮细胞内,且能明显减轻人脐静脉内皮细胞的缺氧/复氧损伤。这种蛋白转导方式,为用 SOD1防止在体缺血/再灌注损伤的研究奠定了基础。
- 王家宁丁鹏黄永章骆丽娜郭凌郧孔霞邵芳
- 关键词：再灌注损伤超氧化物歧化酶人脐静脉内皮细胞
- PEP-1肽介导人Cu,ZnSOD转导入人脐静脉内皮细胞被引量：11
- 2006年
- 目的:构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,观察表达的融合蛋白PEP1SOD1能否进入细胞.方法:以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA.经酶切后分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,分别转化大肠杆菌,表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞.结果:得到高纯度的、有活性的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白.PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,并表现出剂量依赖性和时间依赖性的特点;一旦进入细胞,PEP1SOD1融合蛋白可以维持48h.结论:PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,为SOD1进入组织细胞内发挥治疗作用提供了实验基础.
- 丁鹏王家宁黄永章骆丽娜邵芳
- 关键词：超氧化物歧化酶融合蛋白
- PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化被引量：9
- 2006年
- 目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。
- 丁鹏王家宁杨波黄永章骆丽娜
- 关键词：原核表达TA克隆融合蛋白
- 原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建被引量：10
- 2006年
- 目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。
- 丁鹏王家宁黄永章杨波
- 关键词：铜锌-超氧化物歧化酶TA克隆基因重组蛋白转导域
- 利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒被引量：29
- 2005年
- 目的利用pGEM-TEasyvector构建pET15b-SOD1重组质粒。方法以pBluescriptIISK-SOD1质粒为模板,应用pfuDNA聚合酶,聚合酶链反应法(PCR)扩增SOD1cDNA。将扩增的SOD1cDNA与三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,然后通过TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在SOD1cDNA的3’末端加“A”并纯化,然后将纯化后的SOD1cDNA与pGEM-TEasyvector直接连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,蓝白筛选,挑选白色克隆扩增、鉴定,重组的质粒命名为pGEM-TEasy-SOD1。pGEM-TEasy-SOD1和pET15b分别用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切,采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片断,前者回收470bp的SOD1cDNA片段,后者回收线性化的pET15b片段,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,抽提后的重组体质粒命名为pET15b-SOD1,然后对pET15b-SOD1进行酶切和核苷酸序列测序鉴定。结果重组质粒pET15b-SOD1经测序分析证实克隆入pET15b-SOD1的人SOD1cDNA与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1cDNA序列一致,从而成功构建了pET15b-SOD1重组质粒。结论pET15b-SOD1重组质粒的构建为细胞穿透肽介导的SOD1转导提供了一对照载体。
- 丁鹏王家宁黄永章杨波
- 关键词：超氧化物歧化酶基因重组原核表达载体
