孙阳阳
- 作品数：5 被引量：16H指数：3
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- shRNA沉默EIF4E基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞VEGF-C表达的影响被引量：2
- 2011年
- 目的:探讨shRNA沉默EIF4E基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞EIF4E及VEGF-C基因表达的影响。方法:制备针对EIF4E的三种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),分别是siRNA1、siRNA2、siRNA3,筛选沉默最有效的siRNA,据此设计短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)寡核苷酸链,与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接,构建pGPU6/GFP/Neo-EIF4E重组质粒,经酶切鉴定后利用脂质体Lipofectamine^(TM) 2000将鉴定正确的重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学法检测EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达情况。结果:RT-PCR结果显示siRNA1、siRNA2、siRNA3对乳腺癌MDA-MB-231细胞EIF4E基因表达均有抑制作用,与空白对照组、阴性对照组、脂质体组比较差异显著(P<0.05),尤以siRNA3抑制率最高达71.2%。利用针对siRNA3合成的shRNA与质粒载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E,酶切鉴定表明构建成功,并稳定转染MDA-MB-231细胞,平均转染效率为80%。RT-PCR、Western blot结果显示,稳定转染重组质粒后MDA-MB-231细胞EIF4E及VEGF-C mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05),抑制率分别为79.00%、67.90%(EIF4E)和77.01%、62.94%(VEGF-C)。免疫细胞化学染色法显示重组质粒组EIF4E及VEGF-C蛋白表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论:靶向EIF4E的shRNA不仅能有效沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中EIF4E的表达,且能抑制VEGF-C的表达,提示EIF4E可能参与诱导乳腺癌细胞VEGF-C的表达,而EIF4E-shRNA可能成为抑制乳腺癌淋巴管生成的一种新的有效手段。
- 孙阳阳曹友德刘浩叶维霞
- 关键词：MDA-MB-231细胞小干扰RNA
- miR-206抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞Cdc42蛋白表达及其对细胞骨架的影响被引量：4
- 2010年
- 目的探讨miR-206对MDA-MB-231乳腺癌细胞Cdc42表达的调控及对细胞骨架的影响。方法采用Li-pofectamineTM2000转染miR-206进入MDA-MB-231细胞,48h后Western blot检测转染后乳腺癌细胞Cdc42、MMP-2和MMP-9蛋白质表达。用免疫荧光显微镜观察细胞丝状伪足的改变,进一步用侵袭迁移实验检测转染前后细胞侵袭力和迁移力的变化。结果Western blot检测Cdc42、MMP-2和MMP-9在转染前后的表达结果,其条带灰度值与阴性对照组相比明显下降(P<0.05);细胞免疫荧光计数每个细胞平均丝状伪足数,空白对照组为(14.99±5.53),表皮生长因子(EGF)组为(23.59±3.92),miR-206转染组为(9.45±3.59),miR-206+EGF组为(11.77±2.85)。与空白对照组和EGF组比较,miR-206转染组或miR-206+EGF组细胞丝状伪足明显减少(P<0.05)。侵袭实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(311.7±23.5),miR-206转染组为(65.0±13.9),二者差异有统计学意义(P<0.01)。迁移实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(793.0±76.3),而miR-206转染组为(415.3±20.0),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论miR-206能抑制MDA-MB-231细胞Cdc42的表达和细胞丝状伪足的形成,并且能抑制细胞的侵袭迁移能力。
- 刘浩曹友德叶维霞孙阳阳
- 关键词：乳腺肿瘤CDC42
- siRNA下调EIF4E基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和周期的影响被引量：5
- 2011年
- 目的:应用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)乳腺癌MDA-MB-231细胞中真核细胞翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, EIF 4E )基因的表达,探讨其对乳腺癌细胞增殖和生长周期的影响。方法:构建针对EIF 4E 基因的siRNA表达质粒,采用脂质体法将表达质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞;分别采用RT-PCR、Western 印迹法和免疫细胞化学法检测转染EIF4E siRNA后, 对MDA-MB-231细胞中EIF4E及cyclinD1 mRNA和蛋白的表达水平的影响;MTT法、平板克隆形成实验和FCM检测MDA-MB-231细胞增殖活性、克隆形成率及细胞周期。结果:成功构建EIF4E siRNA表达质粒。RT-PCR、Western 印迹法和免疫细胞化学法检测结果显示,MDA-MB-231细胞中EIF4E及cyclinD1 mRNA和蛋白表达均明显下降(P <0.05)。转染EIF4E siRNA组细胞生长缓慢,集落形成数明显减少,与空白对照组和转染空载体组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,EIF4E siRNA转染组G1期细胞所占百分比为(71.30±0.47)%, 较空白对照组的( 53.10±0.43)%明显增加,而S期细胞所占百分比为(12.53±0.13)%,较空白对照组的(26.47±0.38)%明显减少(P<0.05)。结论:EIF4E siRNA可显著下调EIF4E基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达水平,在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖,有可能成为临床治疗乳腺癌的靶点之一。
- 孙阳阳曹友德叶维霞磨娜
- 关键词：乳腺肿瘤真核细胞翻译起始因子
- shRNA沉默EIF4E基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响
- 目的:真核翻译起始因子4E(EIF4E)做为细胞生长和分化过程中重要的调控因子,与肿瘤的发生有着密切的关系。本研究通过转染人EIF4E基因的小干扰RNA(small interfering RNA)表达质粒,探讨其对乳腺...
- 孙阳阳
- 关键词：重组表达质粒MDA-MB-231细胞细胞生长周期免疫细胞化学法免疫荧光法检测
