蒋栋
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 供职机构：北京医科大学人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金美国中华医学基金会项目美国中华医学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物的初步应用
- 2000年
- 目的:建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗HCV阳性血清的反应情况。方法:用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ从原核表达载体pMSCVE1中切下HCVE1区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体PcDNA3.1中,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中,同时利用WesternBlot方法对表达产物进行鉴定;测定表达产物与20份抗HCV阳性血清标本和10份抗HCV阴性的血清标本的反应性。结果:经酶切过夜后从原核表达载体上切下的基因片段与经过同样双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了预期大小的354bp的片段。经磷酸钙转染,产生了具有对G418抗性的细胞克隆,经WesternBlot方法用抗HCVE1区合成肽抗原的单抗检测表达产物,产生了特异的反应;并证实该表达产物与HCV患者的血清有特异反应。经WesternBlot证实在抗HCV阳性血清中有35%(7/20)可与表达产物产生特异的反应;阳性细胞经3个月传代后,仍可检测到HCVE1的表达产物。结论:此项研究所建立的能够表达HCVE1基因细胞系表达产物可与阳性血清发生特异性反应,该细胞系的建立为进一步研究抗HCVE1抗体的临床意义及进行有关HCV核酸免疫的研究创造了条件。
- 高建恩陶其敏马大龙冯百芳蒋栋
- 关键词：真核细胞丙型肝炎病毒基因表达
- 丙型肝炎病毒 HCV E1区基因的真核表达载体构建及序列分析被引量：2
- 1999年
- 建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体，并通过对其序列分析阐明其作为基因接种的可能性。方法：经常规ＲＴ－ＰＣＲ法从ＨＣＶ ＲＮＡ阳性病人的血清中扩增出ＨＣＶ Ｅ１区的基因片段，经ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶发后将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３中，阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定以脱氧终止法测序，同时利用计算机软件对其推定的氨基酸序列进行分析。
- 高建恩蒋栋陶其敏纪和平季颖冯百芳
- 关键词：丙型肝炎病毒基因表达
- 丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系“饵”载体的构建及表达被引量：3
- 2000年
- 目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus,HCV)胞膜蛋白 2 (envelopeprotein 2 ,E2 )胞外区片段 ,构建酵母双杂交体系中“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,验证其能否用于酵母双杂交体系筛选cDNA文库。方法 :设计引物 ,从本室构建的含中国株Ⅲ型HCVE2片段的载体上 ,扩增出不包含C末端跨膜区的E2片段E2 6 6 1,经EcoRI和PstI双酶切后 ,克隆到酵母双杂交的“饵”载体pAS2 1质粒上 ,构建成载体pAS2 1 E2 6 6 1。阳性克隆经EcoRI和PstI双酶切鉴定后 ,转入酵母中 ,用酵母蛋白抽提物作Western杂交 ,证实其表达 ;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。结果 :所构建的载体 pAS2 1 E2 6 6 1双酶切后 ,片段大小正确 ;转入酵母后 ,提取酵母质粒 ,PCR扩增出预期大小的片段 ,Western杂交出现阳性条带 ;滤膜杂交 ,转有 pAS2 1 E2 6 6 1和阴性对照pLAM5 ' 1的酵母菌落没有激活报告基因 ,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色。结论 :含有HCVE2 6 6 1的“饵”载体构建正确 ,在酵母细胞中能表达出E2蛋白 ,并且没有自身激活报告基因的功能 ,能够应用于酵母双杂交体系。
- 梁庆华蒋栋谢尧范涛陶其敏
- 关键词：丙型肝炎病毒E2蛋白
