许雪梅
- 作品数：12 被引量：13H指数：2
- 供职机构：中国医学科学院基础医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 基于自转运蛋白Ag43的HPV16L1蛋白的细菌表面展示被引量：1
- 2022年
- 目的:通过构建含有不同大小乘客结构域的Ag43表面展示载体,观察其将外源蛋白HPV16L1展示在细菌细胞表面的效率。方法:(1)利用基因工程手段将不同长度的Ag43基因序列连接到pET22b载体,获得4种Ag43表面展示载体:Ag43/138、Ag43/551、Ag43/552、Ag43/700;(2)克隆HPV16L1编码基因序列,利用基因工程手段将其分别连接到上述4种Ag43表面展示载体,获得4种重组蛋白表达载体;(3)HPV16L1-Ag43融合蛋白表达及SDS-PAGE分析;(4)利用胰蛋白酶消化验证HPV16L1蛋白在大肠埃希菌的表面展示。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增获得的Ag43和HPV16L1条带与预期大小一致,表面展示载体和重组蛋白表达载体的基因序列均通过基因测序验证无误。经IPTG诱导后,构建的4种Ag43表面展示载体均能表达HPV16L1蛋白。胰蛋白酶消化后,4种重组蛋白条带均减弱,且Ag43/700-HPV16L1条带减弱最明显。结论:成功构建了基于自转运蛋白Ag43的细菌表面展示载体,HPV16L1蛋白可通过构建的4种Ag43表面展示载体表达并展示在大肠埃希菌表面,且仅保留α-螺旋和β-桶状结构域部分的Ag43表达载体即Ag43/700的表面展示效果最优。
- 蔡锟王哲黄丕英韦良婉王星媛许雪梅储引娣朱沛沛范恩国
- 关键词：HPV16L1
- 双重引物聚合酶链反应同时检测人乳头瘤病毒及沙眼衣原体
- 1997年
- 本研究于国内首次建立了人乳头瘤病毒／沙眼衣原体两对引物ＰＣＲ技术，即ＨＰＶ／ＣＴ双重引物ＰＣＲ。将设计在人乳头瘤病毒（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１６型早期基因Ｅ１保守区的一对共有引物和设计在沙眼衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，ＣＴ）隐蔽质粒区的一对引物同时加入同一反应体系，一次反应可同时检出泌尿生殖道标本中存在的ＨＰＶ和ＣＴ的单独或混合感染；对设计的两对引物做了敏感度、特异性试验。结果表明，０．１ｆｇＨＩＺＰ－ＨＰＶＤＮＡ及１～２个拷贝的沙眼衣原体即可被检出，且只对ＣＴＬ２ＥＢ血清型及ＨＰＶ６、１１、１６、１８型ＤＮＡ有扩增产物出现，而对人基因组ＤＮＡ、ＨＣＭＶＤＮＡ、ＨＳＶ－２ＤＮＡ、大肠杆菌Ｍ１０９ＤＮＡ、奈瑟氏淋球菌ＡＴＴＣＣ２９４０２ＤＮＡ、解脲支原体Ｔ８ＤＮＡ无扩增产物；并用该方法对２９例临床标本（１８例尖锐湿疣、１１例宫颈癌）中的ＨＰＶ和ＣＴ感染进行了检测，同时用ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ对２９例病理确诊后标本中ＨＰＶ感染进行了对比检测；用ＣＴ－ＭＯＭＰ蛋白基因区单重引物ＰＣＲ对１８例尖锐湿疣的ＣＴ感染进行了对比检测。结果表明，ＨＰＶ和ＣＴ相应的两种检测方法的检测?
- 许雪梅司静懿周四方刘世德徐建青宋国兴李昆王家璧刘耀华王宏伟
- 关键词：人乳头瘤病毒沙眼衣原体聚合酶链反应
- H1N1流感病毒HA蛋白疫苗构建策略的筛选被引量：1
- 2022年
- 目的筛选并确立流感病毒H1N1 A/Nebraska/14/2019血凝素(HA)的最佳蛋白疫苗策略。方法分别构建HA全长、HA胞外区C端不同的突变体及共表达HA/M1的重组杆状病毒,感染昆虫细胞表达80 h后,收取培养上清,Western blot鉴定重组抗原的表达,同时采用血凝试验间接分析其免疫原性。然后大量表达HA/M1蛋白,Core700纯化后分析蛋白颗粒的理化性质、血凝活性及稳定性。结果2种HA胞外区的C端突变体虽均以三聚体形式表达,但表达上清无血凝活性;HA全长三聚体具有较好的血凝活性,但为膜蛋白,纯化难度大。HA/M1共表达上清具有血凝活性,HA/M1表达上清经Core700纯化,透射电子显微镜分析显示为80 nm~150 nm病毒样颗粒(VLP)。HA-M1-VLP的血凝效价高达26,动态光散射显示HA-M1-VLP在4℃保存3个月性质稳定。结论HA-M1-VLP易于表达纯化、稳定性好,且血凝活性高,可用于流感病毒H1N1蛋白疫苗的研究。
- 郑宁晨杨姣姣张婷王志荣许雪梅
- 昆虫细胞表达的HPV-58 L1病毒样颗粒的层析纯化及免疫原性分析
- 2022年
- 目的探索利用昆虫杆状病毒表达系统(IBEVS)表达的重组人乳头瘤病毒(HPV)58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)的简单可行的层析分离方法。方法收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀(ASP)联合层析法纯化L1蛋白的最佳条件,对纯化后的蛋白进行体外组装。对L1蛋白的纯化各个阶段中的组分、最终产品(纯品蛋白)及组装状态进行理化性质鉴定,分析其免疫原性。结果30%饱和硫酸铵(AS)分级分离后,L1蛋白得率为72%,纯度为9.34%;阴离子交换层析经300 mmol/L NaCl缓冲液洗脱后,L1蛋白得率>90%,纯度为13.6%;进一步经羟基磷灰石层析收获流穿液后,L1蛋白得率>80%,宿主蛋白质残留(HCPs)分析和L1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度>99%。经上述3步分离纯化的L1蛋白,其总得率为55.7%,每升细胞悬浮培养液(约3.0×10^(9)个细胞)产量为57~65 mg。动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)分析显示,L1蛋白组装成了形状均一、直径约55 nm的VLPs。该法制备HPV-58 L1 VLPs诱导小鼠免疫系统产生的中和抗体水平与超离法制备的相当。结论本研究所建立的HPV58-L1 VLPs分离纯化方法是一套具有蛋白得率高、活性好,且操作简单等特点的成熟方案,为利用IBEVS生产成本低的HPV多价预防性疫苗奠定基础。
- 王志荣张婷许雪梅
- 关键词：昆虫细胞
- 免疫原-HPV16L1表达产物的制备及抗肿瘤活性的研究
- 人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类双链小分子DNA病毒,主要感染人类的皮肤和黏膜组织,引起相应的临床上皮组织增生性疾病,Rattray等(1996)报道与肿瘤发生密切相关的高危型HPV...
- 宋国兴王立良许雪梅陈莲凤刘世德司静懿李昆
- 关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒二硫键
- 文献传递
- HPV31型L2保守中和表位可诱发广谱中和抗体被引量：1
- 2017年
- 目的研究人乳头瘤病毒31型(HPV31)次要外壳蛋白L2保守中和表位的免疫活性及诱发抗体的中和范围。方法合成法获得HPV31 L2 aa.17-40多肽,用EDC法偶联KLH,联合弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,用假病毒中和实验检测免疫血清对来自α4、α7、α9、α10及β1亚属的多个HPV型别的中和抗体。结果 HPV31 L2-KLH偶联肽可在新西兰大白兔体内诱发针对至少17种HPV型别的广谱中和抗体,其中HPV31的中和抗体滴度最高,HPV5/45/57的次之。结论首次发现HPV31 L2保守中和表位免疫血清具有广谱中和活性,为基于该表位的广谱HPV疫苗研发奠定了基础。
- 张婷陈雪刘洪洋周艳王志荣许雪梅
- 去唾液酸糖蛋白受体的研究现状被引量：3
- 2014年
- 去唾液酸糖蛋白受体（ asialoglycoprotein receptor ， ASGPR），也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体，或者 Ashwell-Morell 受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性，因此属于 C 型凝集素。ASGPR 能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR 的配体非常多，提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。
- 张黎黄维金许雪梅王佑春
- 关键词：去唾液酸糖蛋白受体RECEPTOR自身免疫性细胞表面细胞内吞唾液酸化
- 一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株生长特性及其在杆状病毒表达系统中的应用被引量：1
- 2020年
- 从雌性草地夜蛾蛹中分离得到的昆虫细胞系(Sf)在杆状病毒昆虫细胞系统(Baculovirus-insect cell system,BICS)中被广泛用作重组蛋白生产的宿主。然而,2014年Ma H等发现该细胞系受到一种病毒的污染,该病毒现在被称为新弹状病毒(Sf-rhabdoviru,Sf-RV)。这提出了一个潜在的安全问题,可能对作为商业重组蛋白生产平台的BICS产生不利影响。因此,我们筛选一种Sf-RV阴性的Sf9细胞株,命名为Sf9-ZY,逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测表明,在连续培养的25代过程中,Sf9-ZY细胞没有检测到Sf-RV。Sf9-ZY细胞的一般特性,包括平均生长率、直径,与Sf9细胞基本相同;Sf9-ZY细胞和Sf9细胞产生感染性杆状病毒水平相当;Sf9-ZY和Sf9细胞培养重组杆状病毒表达重组蛋白水平相当。上述结果表明,Sf9-ZY细胞可作为改良的替代宿主,以规避与使用Sf-RV污染的Sf9细胞制造重组蛋白有关的潜在安全危险。
- 苗丽侯玉婷刘发明朱蕾吴海华宋力强赵雪杨屹许雪梅郭世杰
- 关键词：SF9细胞杆状病毒
- EV71外壳蛋白表位肽多克隆抗血清的制备及鉴定
- 2022年
- 目的制备肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白表位肽多克隆抗血清。方法利用5种B细胞表位预测软件对EV71外壳蛋白进行分析,设计针对病毒蛋白(VP)的4种表位肽,即VP1(aa.204-223)、VP2(aa.133-163)、VP3(aa.139-148+aa.173-191)和VP4(aa.1-23),化学合成后与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联得到相应肽。然后,分别联合MF59/CpGC274佐剂皮下免疫BALB/c小鼠6次,间隔2周,采集血清,用ELISA和Western blot对其抗体活性进行分析。结果4种抗血清均可有效结合EV71病毒和其变性病毒,VP2抗血清与变性病毒的结合活性较高,其余3种与病毒及变性病毒的结合力相当;而且4种抗血清均可与病毒样颗粒(VLP)及变性VLP结合。VP1和VP2抗血清分别与EV71 VLP中的组成蛋白VP1和VP0(VP2和VP4前体蛋白)结合,其中VP2抗血清的结合活性最好,VP1抗血清次之;同时,VP1和VP2抗血清还可与EV71病毒特异性高效结合,且VP2抗血清可同时结合EV71病毒的空心颗粒的VP0及实心颗粒的VP2。VP3和VP4抗血清与VLP和病毒未显示明显的结合活性。结论成功制备了4种EV71表位肽多克隆抗血清,为ELISA和Western blot提供检测工具,并可用于EV71疫苗质控(QC)研究。
- 李晨张婷王志荣许雪梅
- 关键词：肠道病毒71型疫苗外壳蛋白表位肽抗血清
- 表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素(HA)蛋白疫苗的筛选研究被引量：1
- 2023年
- 目的:筛选表达量高、血凝活性好的H3N2流感病毒血凝素(HA)重组蛋白。方法:以A/MINNESOTA/41/2019(H3N2)毒株的HA为基础,将HA胞外区N端融合GP67信号肽,C端融合三聚化基序,分别构建HA胞外区全长及近膜区截短2个氨基酸的HA重组杆状病毒,并构建相应的不含三聚化基序的HA重组杆状病毒;经昆虫细胞表达,Western blot鉴定,亲和层析纯化后分析重组蛋白的血凝效价及稳定性。结果:四种HA重组蛋白均获得有效表达,其中HA胞外区全长融合三聚化基序的重组蛋白(HA-T)表达水平最高,经Strep tag亲和层析获得高度纯化,产量高达30 mg/L,Ethylene glycolbis交联分析显示为稳定的HA三聚体形式,血凝活性分析显示HA-T的活性最高,血凝效价为29,动态光散射显示HA-T在4℃放置3个月性质稳定。结论:HA-T表达量高、稳定性好、血凝活性高且易于纯化,研究结果为流感重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考。
- 杨姣姣郑宁晨张婷王志荣许雪梅
- 关键词：H3N2重组蛋白疫苗
