杨军伟
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 供职机构：中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- 人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶重组蛋白的构建、纯化及酶活性研究
- 2009年
- 目的构建人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)重组蛋白并加以纯化,利用不同底物研究酶活性。方法细胞内Ⅰ型PAF-AHβ亚基基因进行PCR扩增,目的基因经纯化、连接载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组蛋白,提取质粒行琼脂糖凝胶电泳、NdeⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞诱导蛋白表达和纯化,15%SDS-PAGE和Western blotting鉴定。分别以乙酸苯酯、l-O-hexadecyl-2-deoxy-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine(2-Thio PAF)和1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine为底物(后两者为血浆型PAF-AH的商业化底物),应用分光光度法检测纯化后重组蛋白的酶活性,以血浆型PAF-AH作为阳性对照。结果人细胞内PAF-AHⅠ型β亚基重组蛋白构建正确,纯化后在大肠杆菌感受态细胞中诱导表达。与阳性对照血浆型PAF-AH比较,纯化后的重组蛋白同样能够水解乙酸苯酯,具有芳香酯酶活性;能快速水解2-Thio PAF,但不能水解1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidyl-choline。结论成功构建人细胞内Ⅰ型PAF-AH重组蛋白,其对血浆型PAF-AH的两个商业化底物具有完全不同的水解能力,以此可快速区分细胞内和血浆型PAF-AH。
- 陈晓莹徐静杨军伟张怡轩
- 关键词：重组蛋白纯化酶活性底物
