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增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位: 2013年; 【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异(43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219,P<0.01);【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。; 马帆周宇高亚可朱鹏雷小灿刘庆友石德顺; 关键词：水牛 PCNA

水牛HSD17B1基因克隆分析及其真核表达载体构建被引量：3: 2016年; 为了阐明水牛17β-羟类固醇脱氢酶1(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1,HSD17B1)基因对水牛繁殖性能的影响,本试验采用了3′-RACE克隆获得HSD17B1基因,并对其核苷酸序列和蛋白质序列进行了生物信息学分析,通过构建其真核表达载体并转染293T细胞验证所构建载体的准确性。结果表明,水牛HSD17B1基因编码区长954bp,3′-UTR区长58bp,编码317个氨基酸。BLAST分析显示水牛HSD17B1核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、犬、非洲象和人的相似性分别为100%、100%、92%、94%、87%、87%和87%,系统进化树分析结果表明,HSD17B1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。蛋白质分析结果表明HSD17B1蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚定位于细胞质,存在type1_17beta-HSD-like_SDR_c、PRK05993、LPOR和FabG等结构域。试验成功构建了水牛HSD17B1基因真核表达载体pEGFPN1-HSD17B1,转染293T后,产生较强的绿色荧光信号,表明能够形成HSD17B1-EGFP融合蛋白。水牛HSD17B1基因的克隆及其真核表达载体的成功构建,为今后阐明HSD17B1基因在水牛卵泡及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。; 朱鹏庞春英邓廷贤段安琴陆杏蓉陈明棠杨炳壮梁贤威; 关键词：水牛克隆分析

水牛浮舰蛋白2基因克隆及序列分析被引量：2: 2016年; 试验旨在克隆水牛浮舰蛋白2(Flotillin 2,FLOT2)基因并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛发育繁殖中的作用奠定基础。本研究通过PCR扩增获得了FLOT2基因全长并进行克隆测序,结合生物信息学分析方法,预测及分析其蛋白质结构。结果表明,水牛FLOT2基因编码区长1 287bp,编码428个氨基酸,3′UTR区长277bp。多重序列比较分析显示,水牛FLOT2基因核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、小鼠、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、98%、97%、90%、93%、92%和92%,系统进化树分析结果表明,FLOT2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对FLOT2蛋白质的分析表明,该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于细胞质中,存在SPFH_flotillin和SPFH_hflk等结构域。microRNA预测结果表明,bta-miR-2438、bta-miR-2379和bta-miR-1777a可能是其3′UTR潜在靶标。研究结果为今后阐明FLOT2基因在水牛繁殖性能中的功能,尤其是在配子及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了基础。; 段安琴庞春英朱鹏邓廷贤陆杏蓉梁贤威; 关键词：水牛克隆

黄牛类胚胎干细胞的培养: 本研究采用分离着床前囊胚的内细胞团的方法培养黄牛类胚胎干细胞,通过对分离胚胎内细胞团方法和控制饲养层密度以及传代方法的培养条件的实验摸索,得出以下结论:使用器械分离法分离出囊胚内细胞团,使其贴壁在密度为80％的饲养层生长...; 马玉洁劳艳萍朱鹏阮秋燕雷钏杜姗姗王萍陆凤花石德顺; 关键词：黄牛胚胎干细胞; 文献传递

一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法: 本发明涉及细胞穿膜肽靶向运输的技术领域，特别涉及一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法，所述方法包括PEP‑1‑EGFP和EGFP片段的优化、原核表达载体pCZN1‑PEP‑1‑EGFP和pCZN1‑EGFP...; 朱鹏梁贤威庞春英邓廷迟段安琴陆杏蓉; 文献传递

水牛ALK5基因克隆分析与组织表达模式研究被引量：1: 2015年; 为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。; 朱鹏赵鲜红粟小平苏节刘金凤刘庆友石德顺; 关键词：水牛克隆分析

水牛STAT1基因多态与产奶性状关联分析被引量：2: 2016年; 本研究旨在检测水牛STAT1基因的单核苷酸多态性(SNP),探究中国水牛多态性位点的群体遗传特征,寻找与产奶性状相关的分子标记。采用PCR和测序法筛选水牛STAT1基因序列的SNPs,以357头水牛为研究对象,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)对群体进行了基因型检测,运用SAS(9.3)软件一般线性模型(GLM)对STAT1基因型与产奶性状的关联程度进行统计分析。结果表明,在水牛STAT1基因中检测出3个突变位点,分别位于5′UTR(g.68G>A)、外显子10(g.986G>T)和3′UTR(g.2881C>A)。关联分析结果显示,水牛STAT1基因g.986G>T位点与305天产奶量和乳脂率显著关联(P<0.05)。Bonferroni t检验多重比较结果显示,基因型TT和GG个体的305天产奶量显著高于GT基因型(P<0.05),基因型TT个体的乳脂率显著高于GG和GT基因型(P<0.05),且305天的产奶量随着胎次的增加呈现上升趋势,直到第3或4胎次时达到最大值,表明胎次是影响水牛产奶量的重要环境因素之一。本研究表明,水牛STAT1基因的g.986G>T位点可能是影响其产奶性状的候选分子遗传标记,为今后建立中国水牛标记辅助选择育种研究奠定基础。; 邓廷贤庞春英朱鹏段安琴陆杏蓉杨炳壮梁贤威; 关键词：水牛产奶性状飞行时间质谱

一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法: 本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入g...; 刘庆友石德顺粟小平刘帅朱鹏冯万有崔奎青; 文献传递

沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测: 2016年; 【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5′侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%,96%,93%,95%,90%和79%。对其5′侧翼序列2 000bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635--586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性。; 段安琴庞春英朱鹏邓廷贤陆杏蓉陈明棠杨炳壮梁贤威; 关键词：沼泽型水牛 VASA基因转录活性

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究被引量：2: 2013年; 本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。; 苏节朱鹏刘庆友雷小灿石德顺崔奎青; 关键词：水牛克隆

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朱鹏

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