亢小玉
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 供职机构：徐州医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- Pitx3基因shRNA敲除慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立
- 目的 构建、筛选并包装大鼠Pitx3 基因shRNA 敲除的慢病毒，建立稳定敲除Pitx3基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5 细胞系.
- 亢小玉高锦
- 关键词：帕金森疾病
- Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建
- 2014年
- 目的筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒,建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23.5细胞系。方法合成三种(分别命名为p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3)含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo,并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的p LV-H1-EF1a载体质粒,均采用慢病毒包装四质粒系统(pRRE/p VSVG/pREV/p LV)包装并转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系(293T细胞)以获取慢病毒p LVsh Six2。收集敲减Six2基因的p LV-sh Six2-1、p LV-sh Six2-2、p LV-sh Six2-3慢病毒质粒及对照质粒上清,感染黑质多巴胺能神经元细胞(MES23.5细胞),分别设为p LV-sh Six2-1组、p LV-sh Six2-2组、p LV-sh Six2-3组及对照组,Western blot法检测各组细胞Six2蛋白表达,鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减Six2的MES23.5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9 000 bp处分别有明显条带,测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。Western blot结果显示干扰序列sh Six2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低,sh Six2-1和sh Six2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的p LV-sh Six2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体,建立了稳定敲减Six2基因的MES23.5细胞株。
- 高锦亢小玉
- 关键词：胶质细胞系源性神经营养因子慢病毒
