李赛赛
- 作品数：6 被引量：5H指数：1
- 供职机构：河南农业大学更多>>
- 发文基金：引进国际先进农业科技计划河南省科技攻关计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测被引量：1
- 2016年
- 目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。
- 张伟强郭豫杰李赛赛王月影陈丽颖杨国宇
- 关键词：新城疫病毒融合标签柔性接头免疫印迹法间接ELISA
- 猪cGAS基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2016年
- 【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪c GAS基因的重组质粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,进行原核表达,得到c GAS蛋白,为进行体外催化合成c GAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏c DNA为模板克隆猪c GAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L^(-1)丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L^(-1)丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪c GAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了c GAS丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L^(-1)丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 k D。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了c GAS融合蛋白,本试验为体外表达c GAS融合蛋白提供技术方法。
- 杜丽丽樊爽爽李赛赛陈佩格陈磊孙士平樊文杰王江王月影钟凯
- 关键词：原核表达
- 口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选被引量：1
- 2016年
- 为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。
- 舒静超李赛赛申欢欢郭豫杰
- 关键词：口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性融合标签
- 靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定被引量：1
- 2016年
- 为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P<0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。
- 郭豫杰张伟强李赛赛王月影鲁维飞高会贞李宏基杨国宇
- 关键词：RNA干扰(RNAI)SHRNA
- 猪EP1基因的克隆与原核表达
- 2017年
- 为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。
- 杜丽丽李赛赛温丙言王江王月影钟凯
- 关键词：原核表达
- 鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白可溶性原核表达、纯化及免疫原性分析
- 传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的3到12周龄雏鸡和青年鸡的一种急性、高度接...
- 李赛赛
- 关键词：结构蛋白重组蛋白免疫原性
