目的体外分析Toll样受体(TLR)4诱导感染微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)小鼠的树突状细胞(DC)功能。方法纯化脱囊隐孢子虫经5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯标记隐孢子虫子孢子,PCR鉴定隐孢子虫种。制备小鼠骨髓源树突状细胞,培养至第7天,于培养板各孔中分别加入1 ml DC,TLR4抗体组加入1 ml脱囊标记的隐孢子虫子孢子(2×10~5/孔)和0.5 ml TLR4抗体(终浓度为1μg/ml),感染组加入脱囊标记的隐孢子虫子孢子1 ml和0.5 ml RPMI 1640培养基,空白对照组加入1.5 ml RPMI 1640培养基。每组各3孔。培养2 h后,流式细胞术检测各组的CD11c^+相对表达水平,Flowjo软件比较各组树突状细胞的成熟情况。感染后24 h,荧光显微镜观察各组隐孢子虫子孢子与树突状细胞的黏附情况。各组CD11c^+相对表达水平间的差异采用χ~2检验。结果纯化后的隐孢子虫经PCR扩增,获得长度为830 bp的条带,鉴定为微小隐孢子虫。流式细胞术检测结果显示,TLR4抗体组和感染组的树突状细胞CD11c^+相对表达水平分别为67.67±1.80和83.37±3.73,与空白对照组(7.06±0.02)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);TLR4抗体组与感染组间差异也有统计学意义(P<0.05)。Flowjo软件分析结果显示,TLR4抗体组的CD11c+相对表达水平的峰值低于感染组,表明TLR4抗体组DC的成熟度低于感染组。荧光显微镜观察发现,TLR4组和感染组的隐孢子虫子孢子均可与树突状细胞发生黏附现象。结论 TLR4可诱导感染隐孢子虫小鼠的DC成熟。
