李坤
- 作品数：118 被引量：49H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院兰州兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项甘肃省中青年科技研究基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 基于塞内卡病毒A猪源中和性Fab抗体的竞争ELISA检测方法的建立与评价被引量：1
- 2025年
- 塞内卡病毒病是由塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)引起的一种主要感染猪的病毒性传染病,监测其流行情况对防控具有重要意义。为了建立一种快速检测SVA中和抗体的ELISA检测方法,本研究利用HEK293F细胞表达SVA特异性猪源Fab(fragment of antigen binding)抗体,经间接ELISA、免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)、病毒中和实验(virus neutralization test,VNT)、蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)等方法验证Fab抗体的生物学活性,将其用生物素标记后作为竞争抗体,以竞争ELISA(competitive ELISA,C-ELISA)反应模式建立一种SVA中和抗体C-ELISA检测方法,并对其敏感性、特异性、重复性、与VNT的符合率进行测定。结果表明,成功制备了1株具有中和活性的Fab抗体,且与SVA之间有较高的亲和力,将其命名为1M33Fab,用生物素标记后命名为Bio-1M33Fab;确定C-ELISA方法的SVA粒子最佳包被浓度为1μg/mL、Bio-1M33Fab最适工作浓度为0.5μg/mL、待检血清样本最佳稀释比例为1:10、酶标亲和素最佳稀释比为1:30000;确定抑制百分率(percent inhibition,PI)为47%时,敏感性和特异性最高,分别为96.88%和100%,且与常见的主要猪病毒病阳性血清不发生交叉反应;批内变异系数范围为1.12%–7.34%、批间变异系数范围为1.10%–8.97%,表明重复性较好;利用该方法和VNT同时检测了224份临床猪血清样本,2种方法的符合率为93.75%。本研究利用SVA猪源Fab抗体成功建立了一种检测SVA中和抗体的C-ELISA方法,为开发检测试剂盒产品奠定了基础。
- 梁玉斌马雪青何宜轩王彩荷李坤李平花付元芳卢曾军杜晓华刘霞孙普
- 关键词：竞争ELISA中和抗体
- 一种抗塞内卡病毒猪源单链基因工程抗体及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种抗塞内卡病毒猪源Fab基因工程抗体及其制备方法和应用。利用单个B细胞抗体技术，从感染和免疫SVA的猪外周血中分选特异性结合SVA的单个B细胞，然后扩增获得SVA抗体IgG的VH和VL基因，并将其插入含CH...
- 马雪青孙普卢曾军李坤李平花曹轶梅付元芳李冬张婧赵志荀袁红刘在新
- B细胞永生化方法的研究进展被引量：6
- 2018年
- B细胞永生化是一个历久弥新的研究课题,如何维持B细胞体外连续传代增殖并表达抗体的特性,对于研制治疗和诊断用抗体类药物和制品具有重要的意义。B细胞永生化的方法包括杂交瘤技术,EB病毒或SV40感染永生化以及遗传修饰法。永生化B细胞能快速有效的产生单克隆抗体,这种抗体能克服异源抗体产生的免疫排斥,是制备单克隆抗体的理想来源,成为研制治疗性单抗的重要方法。本文主要概述了B细胞永生化方法的研究进展与未来的发展方向,以供从事这方面研究的人员参考。
- 王省李坤卢曾军汪肖肖谯雨刘在新曹轶梅
- 关键词：B细胞单克隆抗体永生化
- 识别口蹄疫病毒VP2蛋白C末端线性抗原表位的广谱单克隆抗体及其应用
- 本发明属于生物技术领域，涉及一种识别口蹄疫病毒VP2蛋白C末端线性抗原表位的广谱单克隆抗体及其应用。本发明成功构建了单克隆抗体pOTB‑1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.6，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ...
- 李坤卢曾军 孙颖 樊惠英李平花曹轶梅包慧芳孙普付元芳袁红白兴文马雪青赵志荀张婧 王健李冬张强
- A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用
- 本发明提供了A型塞内卡病毒SVA/HN/11/2017兰兽研全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明在对SVA/HN/11/2017兰兽研进行全基因组测定的基础上，在其基因组cDNA序列的5’端...
- 马雪青孙普李平花卢曾军刘在新曹轶梅白兴文付元芳张婧李坤
- 文献传递
- 一种羊肠道病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒
- 本发明提供了一种羊肠道病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列为：上游引物CEV‑qF：5'‑TCCTCCGGRGCCGTGAATGC‑3'；下游引物CEV‑qR：5'‑CCGA...
- 孙普李平花马雪青张雨星魏达礼赵志荀张婧袁红李坤李冬白兴文卢曾军
- 一种猪源IL-28B作为免疫增强剂在制备猪瘟E2亚单位疫苗中的应用
- 本发明公开了一种猪源IL‑28B作为免疫增强剂在制备猪瘟E2亚单位疫苗中的应用。CSF亚单位疫苗是CSF疫苗中的一种，主要以E2蛋白为抗原制备而成。为了增强E2蛋白的免疫原性，本发明使用IL‑28B做为免疫增强剂，制备了...
- 白兴文卢曾军袁红李坤焦云娟王涛杨宇轩李平花包慧芳孙普张婧李冬曹轶梅刘在新高洁
- 猪圆环病毒3型研究进展被引量：6
- 2023年
- 猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的单股环状闭合DNA病毒,是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原,目前包括4个基因型:PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中,PCV3是近年来新发的一种严重危害养猪业的基因型,已经在全球范围呈现广泛流行趋势,引起了国内外学者的广泛关注。本文主要从病原学、流行病学、临床症状、致病机理、免疫反应和诊断方法对PCV3近年来研究情况进行了综述,为PCV3后期的各方面研究提供参考。
- 曹旭阳袁红孙普李坤杨宇轩邓欣雨焦云娟白兴文卢曾军权富生
- 关键词：病原学流行病学临床症状致病机理免疫反应
- 一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用
- 本发明提供了一种基于E2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用，属于体外诊断产品技术领域。本发明提供的试剂盒包括猪瘟病毒管式化学发光抗体检测反应体系，其中包含的磁微粒混悬液中含有磁微粒偶联猪瘟病毒E2二聚...
- 李坤包艳芳林密何莉袁红蒋韬卢曾军
- 猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建被引量：1
- 2018年
- 为构建猪C型凝集素受体8A（C-type lectin domain family 8，member A，CLEC8A）的单域抗体酵母展示文库，本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析，鉴定出该受体胞外区基因序列，并插入原核表达载体pET28a（＋），在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼，间接ELISA监测抗体滴度，于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA，反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞（EBY100），经细胞内同源重组，成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明，文库大小约为1．6×10 7，文库重组率达90％，文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体，为后续文库筛选奠定基础。
- 魏国燕李坤卢曾军刘在新孙普白兴文李冬陈应理包慧芳李平花付元芳张婧马雪青曹轶梅
- 关键词：流式细胞术
