王金勇
- 作品数：8 被引量：12H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- poly(A)尾对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组感染性的影响被引量：4
- 2008年
- 大部分单股正链RNA病毒的基因组末端含有poly(A)尾,这对病毒基因组RNA的感染性起着非常重要的作用。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,通过突变PCR获得poly(A)尾长度分别为0、5、8、9、10、22、35的全长突变体克隆,经体外转录转染MARC-145细胞,观察细胞病变(CPE),对于能产生CPE的突变克隆,抽提细胞上清中的病毒RNA,通过G-Tailing法鉴定子代病毒基因组的poly(A)尾长度。结果表明:1、poly(A)尾影响PRRSV基因组的感染性,且最小长度为10;2、PRRSV基因组poly(A)尾在感染细胞过程中能被修复。
- 袁海峰姚火春高飞王金勇袁世山
- 关键词：PRRSV感染性
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆5’非翻译区序列缺失突变分析
- 对单股正链RNA病毒的研究发现：基因组5’非翻译区(5’UTR)在病毒的复制，转录，翻译过程中发挥了至关重要的作用。对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)5'UTR的研究意义重大。因此本研究在PRRSV感染性克隆pC...
- 高飞姚火春王金勇余丹丹袁世山
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征感染性克隆体外转录反向遗传系统
- 文献传递
- 猪生殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区序列的反向遗传操作被引量：2
- 2007年
- 以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5′非编码区(5′UTR)和ORF1起始密码子之间插入NdeⅠ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5′UTR替换为欧洲株的5′UTR,获得全长克隆pTLV8。以体外转录的RNA转染MARC-145细胞。结果显示,pTLNd4产生了细胞病变(CPE),而pTLV8未产生。通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验。证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5′UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子。
- 高飞姚火春孙志王金勇袁世山
- 关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒感染性克隆体外转录转染
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白编码基因重叠区的分离
- 通过将PRRSV感染性克隆ORF间(ORF1/2、ORF4/5、ORF5/6、ORFl6/7和ORF7/3’UTR)重叠区域拉开并插入酶切位点等反向遗传操作，构建了一系列突变的全长质粒，随后进行了病毒拯救和复制分析。结果...
- 余丹丹孙志王金勇袁世山
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒感染性编码蛋白
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6和ORF6/7重叠区的分离(人工)改造病毒的构建及鉴定被引量：2
- 2008年
- 为了研究重叠序列在病毒繁殖周期中所起的作用以及更好地操作感染性克隆,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆ORF间(ORF5/6和ORF6/7)重叠区域分离并插入酶切位点,成功构建两个突变的全长质粒,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明:(1)两个全长质粒均能够进行病毒拯救,并产生明显细胞病变;(2)突变病毒具遗传稳定性;(3)病毒空斑形态及生长曲线与亲本毒株近似。表明PRRSVORF间重叠碱基的安排方式对病毒的感染性是非必需的,获得的两株突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗、研究PRRSV各编码蛋白功能奠定了基础。
- 余丹丹孙志王金勇袁世山
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒感染性反向遗传操作
- 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)3′末端非翻译区中调控序列的研究被引量：4
- 2007年
- 以北美株PRRSV感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,将3′UTR中的一级结构进行了系列缺失或插入突变,并改变二级结构中的一个保守的茎环结构,构建全长PRRSV突变体克隆,解析3′UTR突变对病毒感染性的影响,旨在界定调控PRRSV3′UTR的启动子序列及二级结构,即复制过程中的最小调控元件。以空斑和Northern blot来研究拯救后重组病毒的复制、转录和生长特性,发现重组病毒感染动力学与亲本病毒无可见差别。结果表明PRRSV3′UTR的5′端可耐受一定数目的核苷酸的缺失(41nt)与插入(23nt)突变,但进一步9nt缺失造成保守的环结构突变后就使病毒失去了感染性。证明了这是3′UTR中控制PRRSV复制过程的的必需序列及二级结构,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础。
- 孙志王金勇张建武秦爱健袁世山
- 关键词：PRRSV反向遗传操作MRNA转录
- 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)转录调控序列(TRS)鉴定及其功能解析
- 利用RT-PCR技术确定了PRRSV北美株各TRS-B位置及各sgmRNA Leader-Body junction序列。继而以PRRSV北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作，以点突变PCR对所确定的形成sg...
- 郑海红孙志王金勇朱兴全袁世山
- 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染反向遗传操作
- 文献传递
- PRRSV感染性克隆5′非翻译区序列缺失突变分析
- 2009年
- 在PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上,通过突变PCR获得了病毒基因组5′UTR系列缺失的全长突变体克隆:pCBCM1、pCBCM3、pCBCM5、pCBCM7、pCBCM9、pCBCM45、pCBCM69、pCBCM100,随后将上述突变体体外转录成RNA之后转染MARC-145细胞,进行病毒感染性、复制和转录分析,以鉴定特定的缺失区的调控功能。结果显示,病毒5′UTR起始的第1个碱基是保持病毒感染性非必需的核苷酸;前45个碱基对病毒基因组的复制是非必需的。Northern-Blot结果显示pCBCM1亚基因组mRNA可以进行高效率的转录,而其余突变体的亚基因组转录受到严重抑制。由此证明,PRRSV 5′UTR的完整性对病毒意义重大,碱基的少量以及大部分缺失会对病毒产生极大的影响。
- 高飞姚火春王金勇余丹丹袁世山
- 关键词：感染性克隆体外转录缺失突变反向遗传系统
