目的建立重组蛋白药物罗米司亭中聚山梨酯80含量高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)-电雾式检测器(charged aerosol detector,CAD)检测方法,并对方法进行验证及初步应用,以期为重组蛋白药物制剂的质量控制提供参考。方法通过对流动相的筛选以及方法洗脱梯度和CAD参数的优化建立聚山梨酯80含量的HPLC-CAD方法,并对方法的专属性、重复性、准确性进行验证,确定方法的检测限、定量限和线性范围。采用建立的方法检测2批次罗米司亭样品中的聚山梨酯80含量。结果方法优化后的色谱条件如下:色谱柱为Acclaim Surfactant Plus(150 mm×4.6 mm,3μm);流动相A为含0.1%甲酸的水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的异丙醇;洗脱梯度为0 min 80%A,1.8 min 80%A,2.0 min 66.5%A,3.0 min 66.5%A,3.5 min 0%A,8.5 min 0%A,9.0 min 80%A,15.0 min 80%A;流速为0.6 mL/min;进样量为10μL;柱温为25℃;CAD雾化温度为50℃,幂律函数值(power function value,PFV)为1.25。该方法样品基质和空白溶液中无其他色谱峰干扰;检测低(10 mg/L)、中(50 mg/L)、高(80 mg/L)浓度聚山梨酯80峰面积的RSD分别为4.32%、1.97%和3.46%,平均加标回收率分别为95.7%、99.0%和98.9%;聚山梨酯80在浓度5.0~100.0 mg/L范围内具有良好的线性关系(R^(2)=1.0000),方法的检测限和定量限分别为1.0和2.0 mg/L。采用建立的方法检测2批次罗米司亭样品中聚山梨酯80含量分别为33.20和32.28 mg/L。结论建立的罗米司亭中聚山梨酯80含量HPLC-CAD检测方法灵敏度高,专属性、重复性、准确性良好,可用于重组蛋白药物质量控制过程中聚山梨酯80含量的检测。
目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品中宿主DNA残留检测提供新的思路。方法构建质粒pUC19-E1A-SV40LTA,全基因合成后进行扩增,以得到足够的质粒参考品;采用数字PCR仪,分别用E1A和SV40LTA引物探针体系的双荧光通道对其进行拷贝数检测;将数字PCR标定拷贝数的参考品应用于qPCR中,建立检测E1A和SV40LTA特定序列的方法。对建立的qPCR体系进行质粒参考品线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性验证,并应用建立的qPCR体系对重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)样本进行检测。结果用数字PCR双荧光通道检测质料参考品的E1A和SV40LTA靶点的拷贝数基本一致,其中用E1A引物探针体系检测值为3.55×10^(9)copies/μL,SV40LTA引物探针体系检测值为3.48×10^(9)copies/μL,这两种检测值的变异系数(CV)为1.42%,取平均值3.51×10^(9)copies/μL作为数字PCR的标定值。用数字PCR标定拷贝数建立的qPCR体系线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性良好,检测rAdV、rAAV样本的回收率均在70%130%之间。结论建立了可检测生物制品中E1A和SV40LTA残留的质粒参考品,并引入了更为灵敏和准确的数字PCR方法对其进行定量。该参考品可应用于以HEK293、HEK293T为宿主细胞生产的基因治疗产品中E1A和SV40LTA残留DNA检测。
