马忠辉
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定被引量：5
- 2009年
- 为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法，试验取自怀孕40d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养，用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态；根据牛Y染色体上的性别决定区域（SRY）基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物，同时根据牛403bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物，建立PCR反应体系进行性别鉴定。结果表明：分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖；阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255bp的片段和403bp的β-珠蛋白基因片段，第2，3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403bp的β-珠蛋白基因片段，通过电泳证明PCR产物255bp的片段为SRY基因片段，说明有255bp扩增带的细胞系为雄性；无255bp扩增带的细胞系为雌性。结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养，利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点，可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定。
- 马忠辉赵巧香杨焕民
- 关键词：成纤维细胞细胞分离培养性别鉴定
- 密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达被引量：6
- 2010年
- 目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。
- 马忠辉赵巧香高新王诗鸿宋海峰杨焕民
- 关键词：毕赤酵母电转化
- 冷诱导RNA结合蛋白CIRP单克隆抗体的制备与鉴定
- 冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducibleRNA-binding Protein,CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中发现的冷休克蛋白,属于富含甘氨酸的RNA结合蛋白家族(Glyine-rich RNA-bindd...
- 赵巧香马忠辉尹位李士泽
- 关键词：冷应激单克隆抗体
- 文献传递
- 人GDNF-TAT真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达
- 2009年
- 目的:在毕赤酵母中表达带有TAT多肽的人胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotro-phic factor,GDNF),为探讨GDNF-TAT用于帕金森病的治疗奠定基础。方法:用密码子优化法合成人GDNF基因序列连在pPICZαA,用PCR方法分别在上游引入TAT位点与XbaⅠ酶切位点,下游设计扩增pPICZαA上的α-因子序列。然后插入pPICZαA载体中,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切并测序鉴定,构建GDNF-TAT在毕赤酵母表达质粒pPICZαA-GDNF-TAT。电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白。结果:双酶切pPICZαA-GDNF-TAT后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和432bp片段,表明目的片段已插入载体中,经序列测定其含有完整的GDNF-TAT基因片段,Western印迹结果显示含有pPICZαA-GDNF-TAT的毕赤酵母GS115能分泌表达GDNF-TAT。结论:成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-GDNF-TAT,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达GDNF-TAT。
- 马忠辉高新赵巧香宋海峰
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子电转化毕赤酵母
- 人IFN-β在毕赤酵母中的表达及引入VHB提高人IFN-β产量
- 目的:用基因工程技术改造人IFN-β高表达毕赤酵母工程菌株,探讨改造方法与技术路线。方法:密码子优化合成IFN-β基因,克隆到pPICZαA质粒上,经鉴定后,内切酶Sac I线性化,电转化到毕赤酵母宿主菌GS115,经P...
- 马忠辉
- 关键词：毕赤酵母IFN-Β
- 文献传递
- 表皮生长因子受体-3真核表达质粒的构建及其免疫小鼠抗体滴度的检测
- 2014年
- 目的构建表皮生长因子受体-3(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3,ErbB3)真核表达质粒,并检测其免疫小鼠血清抗体滴度。方法以乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增ErbB3全长基因,插入pcDNA3.1-myc/His载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3。同时以质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3为模板,PCR扩增ErbB3-ECD和ErbB3-RLD基因,插入pET-28a(+)和pGEX-KG载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD;将质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定后,经GST柱或镍亲和柱纯化,BCA法定量纯化后蛋白。以60μg质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,经小鼠尾静脉采血,分离血清,以纯化后的ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白为包被抗原,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度。结果 3种质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白ErbB3-ECD和ErbB3-RLD在相对分子质量约76 000和46 000处可见特异蛋白条带,浓度分别为2和1 mg/ml,免疫后的小鼠血清抗体滴度分别为1︰400和1︰10 000。结论 ErbB3全长质粒免疫BALB/c小鼠后,经ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白初步筛选,已获得ErbB3的多克隆抗体,为后期ErbB3单抗的制备以及以ErbB3为靶点的核酸免疫治疗奠定了基础。
- 张晶刘强马忠辉万德友王瑜付洁宋海峰
- 关键词：表皮生长因子受体核酸免疫
- 乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达
- 2009年
- 目的:在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法:用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果:双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论:构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。
- 马忠辉付洁高新杨焕民宋海峰
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白毕赤酵母真核表达
