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利用绿色荧光蛋白建立包涵体变-复性新方法被引量：2: 2010年; 为提高常规稀释复性方法的复性效率,以重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)包涵体为模型,开发一种新的双变性-稀释复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性复合溶液作为第一变性剂溶解GFP包涵体,通过梯度降低变性液的酸碱度析出溶解目的蛋白,再以尿素为第二变性剂溶解析出的蛋白,随后进行稀释复性。结果显示:与常规方法比,新方法复性的绿色荧光蛋白活性收率提高至1.5～2.3倍,复性蛋白对温度、溶液酸碱度及变性剂的稳定性提高。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)及其融合蛋白的包涵体采用新方法进行复性,均取得80%以上的活性回收率,说明新方法对GFP系列融合蛋白的包涵体具有一定的适用性。新方法从变性剂使用与包涵体结构的关系出发,突破常规操作中变性剂单次使用的局限,既保留了简便性又提高了常规稀释复性方法的效率。; 张颋冯延叶沈亚领金维荣杨忠王菊芳王小宁; 关键词：大肠杆菌包涵体复性绿色荧光蛋白

利用基因芯片技术筛选早期乳腺癌的差异表达基因: 2013年; 目的比较相同病理类型和临床分期预后不同的早期（Ⅰ、Ⅱ期）乳腺癌样本的基因表达差异,寻找有显著差异的基因,探索与早期乳腺癌预后有关的基因分型.方法用Agilent4×44K人全基因组Oligo芯片对47例早期乳腺癌患者的组织样本,结合其预后好、差数据,根据其临床预后的不同分为对照组（预后好）24例和实验组（预后差）23例,进行差异基因表达分析;采用Real-time PCR技术,对两组乳腺癌样本中差异表达的基因进行验证.结果基因芯片检测分析发现,实验组样本比对照组样本有差异表达基因126个,其中60个基因显著上调,66个基因显著下调（差异均在2倍以上）.结论不同预后的早期乳腺癌样本中,基因表达存在显著差异,早期乳腺癌的预后与这些基因的表达有关.; 厉周李秀勤韩帅黄宗海史福军周华彬蔡寨彭亮郝卫金维荣; 关键词：乳腺肿瘤基因芯片分析技术基因分型

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定被引量：8: 2010年; 目的利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区（DENV-1—4 ED Ⅲ），获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ。方法PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因，构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒。酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115，涂板后经G418梯度浓度筛选，获得多株抗G4184．0mg／ml的高拷贝菌株，扩大培养后，利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白，表达上清用Ni—NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定。结果成功构建pPIC9K—DENV-1～4 ED Ⅲ重组质粒，高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白，纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳，相对分子质量约为12×10^3，与实际相符。免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合。结论成功通过毕赤酵母高效分泌表达I～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白，这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究。; 蔡建飘钱菲王嘉颖赵莹徐晓晶金维荣车小燕; 关键词：登革热病毒毕赤酵母基因表达调控病毒

利用Agilent定制基因芯片筛选相同病理类型、不同预后的早期乳腺癌的分子标记物被引量：3: 2013年; 目的分析相同病理类型、临床分期（I～Ⅱ期）但预后不同的乳腺癌组织的基因表达差异，筛选出有意义的基因组合，寻找与乳腺癌预后相关的基因，探索可以早期预测乳腺癌预后的基因分型诊断标准。方法用Agilent定制人8×15000芯片对筛选出的实验组8例早期乳腺癌患者的组织标本，结合其预后数据，进行差异基因表达分析；采用Real．timePCR技术，在同期收集的验证组42例乳腺癌样本中对差异表达的基因进行验证。结果基因芯片检测分析发现，实验组预后差样本比预后好样本有差异表达基因132个，其中44条基因显著上调，88条基因显著下调（差异均在2倍以上）。结论相同病理类型、临床分期、不同预后的早期乳腺癌组织中基因表达存在显著差异，CD44、MK167、NTRK2、Nek2、C160rf60、TOP2A、ANCCA、RRM2等8个基因可以作为早期乳腺癌预后预测基因标记物。; 厉周彭亮韩帅黄宗海史福军蔡寨李秀勤张普生朱卉娟金维荣; 关键词：基因芯片分析技术分子分型

肝癌细胞HepG2基因表达谱的构建与分析被引量：2: 2009年; 为从转录组水平识别HepG2与正常肝组织间的基因表达差异,寻找可能参与肝癌发生发展的重要基因,应用基因表达系列分析技术(SAGE)构建了HepG2的基因表达谱.通过DGED软件进行SAGE标签序列的注释,并与NCBI公共数据库中已有的正常肝脏数据进行比较分析,使用KEGG软件对差异表达基因进行功能分类.共发现HepG2与正常肝组织间差异表达的基因733个,其中表达上调的基因主要与MAPK信号传导通路、细胞周期、细胞粘附等相关,下调基因则主要与烟酸/烟酰胺代谢以及凝血和补体功能相关.荧光实时定量RT-PCR证实了在HepG2中表达升高的IGF2BP2和PEG3基因,在原发性肝癌中的表达亦上调(P<0.05),提示该基因可能是肝癌相关基因.; 金维荣董辉张洪义陈样宜钱震孔亚林沈艳; 关键词：基因表达谱基因表达系列分析 HEPG2

GSTM3过表达或沉默的乳腺癌细胞株MDA-MB-231的构建: 2009年; 为深入研究谷胱甘肽S-转移酶μ3(glutathione S-transferase M3,GSTM3)在乳腺癌中的作用,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/GSTM3,并利用真核表达载体pSilencer2.1U6-neo构建GSTM3特异性siRNA表达载体.重组质粒转染MDA-MB-231细胞,半定量、荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞的检测结果表明,转染GSTM3基因真核表达质粒的细胞株中GSTM3表达明显提高,而转染siRNA表达质粒后,GSTM3的表达则受到显著抑制.; 黄秋梅徐晓晶阳国平赵莹周玲王嘉颖袁洪金维荣; 关键词：乳腺癌 RNA干扰

人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及初步临床应用被引量：4: 2009年; 目的:建立一种检测人血清中脂联素(APN)的酶联免疫吸附方法(ELISA),并初步探讨其在冠心病诊断中的应用。方法:构建表达质粒pET22b(+)/gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中表达并纯化重组脂联素球状区(gAPN)蛋白。用抗APN单克隆抗体MAB10651包被微孔板,10%小牛血清作为封闭液,针对APN不同抗原表位的单克隆抗体MAB1065生物素化后作为标记抗体,联合生物素-亲和素信号放大系统,以gAPN重组蛋白为标准品绘制标准曲线,以准确性、特异性、重复性、回收率试验和方法对比试验评价ELISA方法。检测161例冠心病患者血清APN水平并结合冠状动脉造影结果和Gensini积分系统,探讨血清APN水平与冠心病的关系。结果:利用基因克隆技术成功构建了pET22b(+)/gAPN质粒,获得了相对分子质量约15000的重组gAPN蛋白,产量较高(1.57mg),纯度>90%,并以此为标准品初步建立了检测人血清APN的定量ELISA方法。该法具有良好的准确性和重复性,灵敏度达150pg/ml,回收率为91.0%～108.0%,与深圳依诺金生物科技有限公司进口分装的ELISA试剂盒对照比较有良好的相关性(r=0.935,P<0.001)。临床检测表明冠心病组血清APN水平明显低于非冠心病组(P<0.01),且血清APN水平随冠状动脉狭窄程度的加重呈进行性下降趋势。结论:本实验成功建立了一种简便快速检测人血清APN的ELISA方法,对诊断冠心病有临床应用价值,为国内APN诊断试剂盒的研制和开发提供了科学实验依据。; 李登清陈琳磊何笑恬卫玲曹琳曹洁徐晓晶袁洪金维荣; 关键词：脂联素酶联免疫吸附测定血清学诊断冠心病

基因检测技术在尘肺病预防中的应用研究被引量：2: 2012年; 本文从基因组学、分子医学、临床医学和职业安全健康管理的角度,综合近年来最新的研究成果,阐明应用基因检测技术进行尘肺病易感人群风险筛查的技术原理、可行性及具体做法,从而达到有效降低尘肺病发病率的目的。; 刘祖建金维荣肖自力姜俊成; 关键词：基因检测尘肺病

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