目的探讨微小RNA(miRNA)let-7c参与小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)衰老的机制。方法选择C57BL/6J小鼠40只,将小鼠分为对照组、老年组各20只,通过qPCR技术检测小鼠血清及主动脉血管中let-7c miRNA表达水平。从C57BL/6J小鼠主动脉中提取并原代培养VSMC。通过博来霉素体外诱导细胞衰老模型。使用Lipo2000脂质体转染法过表达或抑制细胞let-7c miRNA表达。将VSMC分为阴性对照(NC)组、博来霉素组、博来霉素+let-7c过表达组、博来霉素+let-7c抑制组,通过衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色评估组织或细胞衰老水平。将VSMC分为控制组、血小板衍生生长因子(PDGF)组、PDGF+let-7c过表达组,采用Western blot检测各组细胞蛋白表达。将VSMC分为空白组、let-7c过表达组、突变组、突变+let-7c过表达组,使用双荧光素酶报告基因验证let-7c靶点。结果老年组小鼠主动脉和血清中let-7c miRNA相对表达水平显著高于对照组(6.37±0.81 vs 1.00±0.00,P<0.05;5.23±0.44 vs 1.00±0.00,P<0.05)。博来霉素+let-7c过表达组中SA-β-gal染色阳性比例较博来霉素组增多,而博来霉素+let-7c抑制组中SA-β-gal染色阳性比例较博来霉素组明显减少(P<0.05)。与PDGF+let-7c过表达组比较,PDGF组血清反应因子表达显著升高,α平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶实验显示,let-7c过表达组中荧光素酶活性水平较空白组显著下降(0.43±0.05 vs 1.00±0.00,P<0.05)。结论miRNA let-7c通过抑制PDGF受体表达促进小鼠VSMC衰老。
目的探讨CD137-CD137配体(CD137L)信号是否通过调控巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达影响血管平滑肌细胞(VSMC)钙化形成。方法采用巯基乙酸盐腹腔灌洗法获取C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞(PM),采用组织块贴壁法取3~6代胸主动脉VSMC分为对照组、共培养组、CD137激动组和MMP-9抑制组(n=3)。对照组用重组CD137L蛋白干预VSMC,共培养组用PM和VSMC共培养,CD137激动组和MMP-9抑制组分别用重组CD137L蛋白和MMP-9抑制剂干预PM后,与VSMC共培养,再加入重组CD137蛋白(10μg/ml)干预。采用Western blot检测各组钙化相关的骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx-2)表达,微板法检测钙离子浓度和碱性磷酸酶(ALP)活性,Von Kossa和茜素红染色检测各组细胞钙化程度。结果CD137激动组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性明显高于共培养组(P<0.01),而MMP-9抑制组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性明显低于CD137激动组,差异有统计学意义[0.25±0.27 vs 2.12±0.34,0.30±0.32 vs 2.63±0.41,(1.92±0.09)mmol/g vs(4.99±0.37)mmol/g,(1.11±0.50)KU/g vs(2.63±0.04)KU/g,P<0.01]。共培养组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性与对照组比较,无统计学意义(P>0.05)。CD137激动组茜素红染色红色颗粒物质沉积和Von Kossa染色黑色颗粒物质沉积明显多于对照组和共培养组;MMP-9抑制组钙化程度显著降低;对照组和共培养组钙化程度则无明显差异。结论CD137-CD137L信号可能通过调控巨噬细胞MMP-9表达影响VSMC钙化形成。
