刘天津
- 作品数：16 被引量：54H指数：5
- 供职机构：中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所更多>>
- 发文基金：上海市自然科学基金江苏省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学自动化与计算机技术电子电信更多>>
- hNIS/TK基因共转染介导^(131)Ⅰ/GCV对肝癌细胞株的毒性作用
- 2010年
- 背景与目的:与传统的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganci clovir,GCV)肿瘤自杀系统相比,人钠/碘同向转运体(human sodium-iodidesymporter,hNIS)是近年来发现的新型治疗基因。然而,两者的疗效尚需进一步提高。本研究旨在探索hNIS介导的放射性核素体系与HSV TK/GCV自杀基因体系对肝癌细胞的联合毒性作用。方法:构建EF1-α启动子调控下的hNIS的表达载体与CMV启动予调控下的GFP和HSV-TK共表达载体,慢病毒包装后转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察重组肿瘤细胞HepG2/NTG荧光蛋白的表达;采用RT-PCR技术进一步检测目的基因hNIS和HSV-TK的表达情况;MTT检测GCV对HepG2/NTG的杀伤作用;摄碘试验及流出试验评价HepG2/NTG对碘的摄取及滞留情况;最后通过克隆形成实验评价GCV和^(131)I对HepG2/NTG的单独及联合杀伤作用。结果:RT-PCR技术、荧光显像证实hNIS、GFP和HSV-TK基因在肝癌细胞中成功表达;与对照组相比,HepG2/NTG的摄碘高出76倍,20 mi n摄碘率最高,其后表现出碘外流,有效半衰期不到10 min,同时这种碘摄取能被NaC1O_4特异性抑制。GCV或^(131)I对HepG2/NTG的毒性作用呈现剂量依赖性:50μg/mL GCV作用72 h后,实验组细胞的存活率仅为(33.98±2.71)%;放射性浓度为7.4 MBq/mL的^(131)I处理7 h后,细胞的存活率仅为(41.17±0.72)%;GCV和^(131)I联合作用后,细胞的存活率仅为(8.55±1.22)%,较单一药物作用细胞存活率下降了6倍。结论:^(131)I/GCV对重组肝癌细胞产生显著的毒性作用,提示慢病毒介导hNIS/TK基因共转染介导肿瘤的放射化学治疗是可行的。
- 郭国英陈立波刘天津郭礼和朱瑞森
- 关键词：肝癌单纯疱疹病毒胸苷激酶
- 人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染被引量：10
- 2008年
- 目的构建人脑源性神经营养因子（hBDNF）与绿色荧光蛋白（GFP）共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞（NSCs）。方法运用基因重组技术，将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD（pWPXL-GFP-IRES-GFP）中，构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP，MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞，包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs，并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确；测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后，荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0．1×10^9～1×10^9 TU／mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光，可在体外扩增，NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性；细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs，转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。
- 刘勇陈二涛冯东福刘天津汪洋潘栋超
- 关键词：转染慢病毒
- 人羊膜上皮细胞移植及基因治疗帕金森病大鼠被引量：9
- 2007年
- 观察人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell,HAEC及)人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF基)因修饰的HAEC在帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)模型大鼠脑内的长期存活和对旋转行为的治疗效果。用包装BDNFcDNA的慢病毒转染原代HAEC(HAEC/BDNF),HAEC/BDNF与HAEC分别植入6-羟基多巴胺损伤的PD模型大鼠纹状体内,观察动物的旋转行为,用免疫组织化学方法鉴定移植物在体内的存活。结果表明,治疗组PD大鼠的旋转行为改善明显达14周,HAEC/BDNF组能使恢复时间提前。免疫组织化学方法发现移植细胞在14周后仍有少量存活且部分表达BDNF、酪氨酸羟化酶,纹状体内星形胶质细胞增生。实验结果说明,HAEC和BDNF基因修饰的HAEC移植对PD模型大鼠的行为有一定改善,HAEC可以作为一种治疗PD的供体细胞。
- 谢慧芳刘天津郭礼和
- 关键词：帕金森病人羊膜上皮细胞脑源性神经营养因子
- 晶状体上皮细胞启动子LEP503调控的自杀基因系统细胞特异性表达研究
- 2012年
- 目的探讨人晶状体上皮细胞（HLEC）特异性启动子LEP503调控的Cre／LoxP增强型自杀基因（HSV-tk／GCV）系统在眼内主要细胞中的特异性表达及杀伤作用。方法实验研究。利用分子克隆技术，构建HLEC特异性启动子LEP503调控的HSV—tk／GCV系统并进行慢病毒包装。分别在HLEC、视网膜色素上皮细胞（RPEC）、小鼠成纤维细胞（NIH3T3）、293T细胞中转人此系统，3d后观察4组细胞增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达情况，并收集HLEC和RPEC，通过RT-PCR检测HSV—tk的表达差异。20mg／L丙氧鸟苷（GCV）作用后，CCK-8试剂盒和流式细胞仪检测HSV-tk／GCV系统对HLEC和RPEC的杀伤作用。采用单因素方差分析Scheffe两两比较法对各组RPEC活性进行比较。结果HSV-tk／GCV系统在RPEC、NIH3T3、293T细胞中EGFP表达效率分别为62．3％，68．3％，75．8％；在HLEC中EGFP表达效率为17．5％。RT—PCR检测显示HLEC内有较高的HSV—tk表达，相对灰度值为4．01，而RPEC中HSV-tk表达微弱，相对灰度值为0．29。20mg／LGCV作用72h后流式细胞仪检测：HLEC组的细胞凋亡率为76．51％，而RPEC组仅为2．44％。CCK-8试剂盒检测细胞增殖抑制情况显示：20mg／LGCV作用72h后LEP503调控的HSV—tk／GCV转染的RPEC活性0．9198±0．06与正常RPE组0．9672±0．02和阴性对照RPE组0．89274-0．07相比，差异无统计学意义[组间均数差值（MD）分别为MD1=-0．047，P=0．671；MD2=0．027，P=0．912]。结论HLEC特异性启动子LEP503调控的Cre／LoxP增强型自杀基因系统在HLEC中能特异性表达HSV．tk，GCV作用后可特异性抑制HLEC增殖，但对RPEC无明显杀伤作用。
- 蒋永祥卢奕刘天津杨晋吴新华
- 关键词：慢病毒属基因表达调控基因自杀DNA结合蛋白质类上皮细胞
- 胶质母细胞瘤肿瘤干细胞体外分离培养鉴定及生物学特性的研究被引量：11
- 2007年
- 目的:探讨人脑胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤干细胞的培养方法,观察其体外增殖、分化等生物学特性。方法:应用改良神经干细胞培养基,11例人脑GBM标本中悬浮培养GBM的肿瘤细胞。采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞。通过免疫组化及电镜观察的方法,确定其干细胞特征;通过核型分析探讨该细胞的肿瘤性质;将确定的脑肿瘤干细胞(BTSCs)接种于不含生长因子的干细胞培养基,观察其在体外条件下分化的特点。结果:本组样本中10例(1例污染)获得具有连续克隆和增殖能力及干细胞特征的肿瘤细胞。结论:人脑GBM中存在具有自我更新和增殖潜能的BTSCs,在体外可将其分离、培养和纯化。
- 车晓明崔大明汪洋施炜刘天津王柯
- 关键词：胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞神经干细胞无血清培养基
- 端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义被引量：3
- 2008年
- 目的探讨端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义。方法对新西兰大白兔11只（22只眼）行超声乳化晶状体吸除术法，术后3个月所有实验动物的晶状体后囊膜均已混浊。20只眼分别取赤道部囊膜、混浊后囊膜组织，采用端粒重复序列扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳法定性和端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附定量法检测其晶状体上皮细胞端粒酶活性。两者端粒酶活性比较采用成组设计t检验。结果以HepG2细胞作为端粒酶检测阳性对照，兔晶状体赤道部囊膜组织、后囊膜均可检测到端粒酶活性，表现为自50bp开始多个模糊梯度条带状电泳图谱，其吸光度A450枷值分别为0．85±0．23、0．67±0．19，两者比较差异有统计学意义（t=2．526，0．021；P〈0.05）。结论在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中存在端粒酶活性，其活性较晶状体赤道部囊膜上皮细胞低。
- 吕志刚黄文丽蒋永祥刘天津
- 关键词：白内障上皮细胞
- 基因转染人羊膜细胞对颅脑创伤大鼠海马的作用被引量：2
- 2010年
- 目的观察移植转染胶质源性神经营养因子（GDNF）基因人羊膜细胞（HACs）对创伤性脑损伤（TBI）大鼠海马神经元的影响。方法采用改进Feeney法制作TBI致海马神经元损伤模型。TBI 24h后于挫伤灶边缘移植，移植处距硬脑膜4mm和2mm深浅两点移植，共5μl含5×10^5个细胞。TBI＋GDNF组移植转染GDNF基因HACs；TBI＋eGFP组移植转染eGFP基因HACs；TBI＋PBS组注射5μlPBS；假TBI组未行移植操作。移植后12d Morris水迷宫检测结束后制片并行焦油紫染色，检测海马及移植针道靶点周围组织，取移植针道靶点周围组织行RT—PCR检测GDNF mRNA水平。结果免疫荧光法检测转染GDNF基因HACs荧光显微镜下呈红色荧光。TBI＋GDNF组大鼠学习记忆功能明显好于TBI＋eGFP组和TBI＋PBS组，TBI＋eGFP组和TBI＋PBS组大鼠损伤侧海马神经元显著缺失，胞体缩小，深染。TBI＋GDNF组部分海马神经元缺失。RT—PCR检测TBI＋GDNF组GDNF mRNA高水平表达。结论移植转染GDNF基因HACs对TBI大鼠海马神经元有保护作用。
- 卢奕惠国桢刘天津刘凤强吴智远李向东暨荀鹤郭礼和
- 关键词：颅脑创伤人羊膜细胞胶质源性神经营养因子动物
- 表达betatrophin的间充质干细胞诱导β细胞增殖和胰岛功能改善
- 目的 间充质干细胞(MSCs)通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能,已被证明在体内能够促进糖尿病个体的胰岛组织再生.近期研究报道,肝脏产生的betatrophin蛋白能够显著地促进小鼠胰岛β细胞细胞增殖,并改善葡萄糖...
- 孙亮亮刘天津汤玮郑骄阳陈向芳邹俊杰石勇铨
- 绿色荧光蛋白和胸苷激酶基因共表达的慢病毒载体的构建及表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建人巨细胞病毒广谱启动子（CMV）调控的增强绿色荧光蛋白（EGFP）和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）共表达的慢病毒载体，获得高效的慢病毒转基因平台。方法采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法，将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中，构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体（Lenti—CMV-HSV-tk-EGFP）。构建成功后的慢病毒三质粒系统通过磷酸钙沉淀法转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T，28h后收集病毒颗粒，测定病毒滴度，并感染人晶状体上皮细胞株、视网膜母细胞瘤细胞株、神经母细胞株、Hela细胞等，荧光显微镜下观察EGFP的表达。RT-PCR检测HSV-tk与EGFP的表达。结果构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达。RT-PCR的结果表明Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP感染细胞能共表达HSV-tk和EGFP，利用该慢病毒载体系统转染人晶状体上皮细胞株时，在复合感染度（MOI）为100时，转染效率接近100％，且传代培养6个月后仍能维持高转染效率。结论成功构建了能转染多种细胞的TK自杀基因和EGFP共表达的慢病毒载体，为眼科自杀基因治疗的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台。
- 杨晋卢奕郭礼和刘天津莫晓芬
- 关键词：慢病毒属发光蛋白质类单纯疱疹病毒属胸苷激酶
- 应用间接谱系转换策略诱导小鼠成纤维细胞转分化为α细胞
- 孙亮亮刘天津李利妹蒋贝格石勇铨
