刘光
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- BAC介导的含97kb人β类珠蛋白基因簇转基因鼠模型的建立被引量：4
- 2003年
- 目的 利用RecA蛋白介导的同源重组的方法,修饰含全长人β珠蛋白基因簇及一段IL-11受体α链基因的(?)C(细菌人工染色体)克隆,建立只包括全长人β珠蛋白基因簇的转基因鼠模型。方法 分别在待删除片段上、下游用PCR合成500 bp左右的两段同源序列,共同克隆人构建载体pBV的HindⅢ和XbaⅠ位点之间,然后以SalⅠ酶切后将此1 kb的插入片段再克隆入温度敏感型穿梭载体pSV-RecA中,转化含B5-BAC DNA的感受态大肠杆菌DH10B,经氯霉素正筛选和镰孢菌酸(FA)负筛选,获得发生两次同源重组后只含修饰后的BACDNA而穿梭载体已丢失的菌株。经脉冲场凝胶电泳鉴定后,纯化修饰的BAC DNA,经显微注射受精卵制备转基因鼠,分析其中的人β珠蛋白基因簇整合和表达状况。结果 利用RecA蛋白介导的同源重组的方法,获得了IL-11受体α链基因被定位删除的含完整人β珠蛋白基因簇的BAC克隆(命名为βD-BAC),建立了3株独立的转基因鼠株系。结论 新的BAC介导的转基因鼠中的人β珠蛋白基因簇显示正确的表达模式和水平。
- 沈伟黄粤唐毅刘德培刘光吴敏梁植权
- 关键词：基因簇细菌人工染色体
- 线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化被引量：1
- 2011年
- 目的获取人线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)基因片段,高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。方法设计引物扩增得到TFAM、TFB1M、TFB2M的cDNA片段,通过引入的酶切位点克隆至表达载体pET42a,构建重组表达载体,并导入E.coliBL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化表达产物,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果获得pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M表达质粒,测序结果与GenBank的基因序列一致。SDS-PAGE分析结果显示,重组GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白分别在相对分子质量56 000、67 000、69 000处出现特异性蛋白条带,经GST亲和层析纯化后,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了基因重组体pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M,制备了GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。
- 刘光杨瑞锋石秉炀刘德培
- 关键词：线粒体转录因子A融合蛋白纯化
- 转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化
- 2007年
- 目的用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系。方法使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14.5d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶NcoⅠ消化后用T4DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式。结果以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当。以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS10和8与其交联效率略低于胎脑。结论在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成。
- 周国岭宋崴付湘辉辛立唐晓彬冯冬晓刘光刘德培
- 关键词：转基因鼠
