张俊峰
- 作品数：29 被引量：21H指数：3
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- 发文基金：河南省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学机械工程更多>>
- 猪多杀性巴氏杆菌5个抗原蛋白的免疫保护效力比较研究
- 2025年
- 为筛选多杀性巴氏杆菌(PM)的优势保护性抗原,本研究利用原核表达系统表达了PM 5个重组蛋白rTorA、rPlpE、rThiB、rPGAM和rPrX,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化该5个重组蛋白后,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达及纯化效果;采用western blot检测各重组蛋白的反应原性。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rTorA主要以包涵体的形式表达,重组蛋白rPlpE以可溶性和包涵体两种形式表达,重组蛋白rThiB、rPGAM和rPrX主要以可溶性形式表达。纯化后分别在91 ku、45 ku、41 ku、32 ku和25 ku处出现单一目的条带,纯化效果较好;western blot结果显示,5个重组蛋白均可与猪PM阳性血清发生特异性反应,表明5个重组蛋白的反应原性均较强;采用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定这5个重组蛋白的浓度分别0.7 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL和0.5 mg/mL。将这5个重组蛋白分别与ISA201佐剂混合制成疫苗后以皮下注射方式免疫小鼠2次,间隔21 d。利用间接ELISA方法检测各组小鼠免疫后不同时间的抗体水平。二免后15 d,分别从各组随机取一半小鼠,以约4 LD50(210 cfu)A型PM A7强毒株第一次经腹腔注射攻毒;7 d后,将各组剩余的小鼠再以相同剂量的PM A7株攻毒。间接ELISA检测结果显示,5个重组蛋白疫苗均能诱导免疫小鼠产生较高水平的IgG抗体。攻毒结果显示,对照组小鼠全部死亡,各蛋白疫苗组(除rPlpE组外)也出现不同程度的发病死亡情况,死亡小鼠剖检均呈典型的败血症性病理变化,从死亡小鼠的心、肺、肝等组织脏器中均能分离到PM;在第一次攻毒试验中,rTorA、rPlpE、rThiB、rPGAM和rPrX疫苗对小鼠提供的免疫保护率分别为60%(6/10)、100%(10/10)、90%(9/10)、70%(7/10)、20%(2/10);在第二次重复攻毒试验中rTorA、rPlpE、rThiB、rPGAM和rPrX疫苗分别对小鼠提供60%(6/10)、100%(10/10)、80%(8/10)、60%(6/10)、40%(4/10)的免疫保护率。两次攻毒试验结果基本一致。
- 孙贺洁孙鑫妍申慧媛张俊峰关丽君董发明董发明薛云
- 关键词：多杀性巴氏杆菌抗原免疫保护
- 稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性被引量：2
- 2017年
- 为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。
- 杨亚东张俊峰张春杰陈松彪程相朝廖成水刘莎莎王二鑫张晓洁尚珂汪洋
- 关键词：PRRSV生物学特性
- 减毒猪霍乱沙门菌△crp△cya△asdC78-1(pYA3493)宿主一载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究
- 引言猪霍乱沙门菌属于革兰氏阴性胞内侵袭性细菌,是引起人类食物中毒和仔猪副伤寒的主要病原之一[1].近年来,减毒沙门菌活疫苗载体己经被应用于诸多领域,尤其是在无抗性宿主-载体平衡致死系统被成功构建以来,更是受到了学者们的青...
- 张俊峰张春杰程相朝尚珂李银聚颜云飞陈桂华金修哲赵战勤
- 表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性被引量：1
- 2016年
- 利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。
- 尚珂程相朝郁川余祖华张俊峰毛福超韩璐韩于佩刘文慧陈桂华
- 关键词：NDVHN生物学特性
- 副猪格拉瑟菌两种重要抗原蛋白的串联表达及其免疫保护效力的研究
- 2024年
- 为获得副猪格拉瑟菌(GPS)亚单位疫苗的高效保护性抗原,本研究利用原核表达系统对GPS重要保护性抗原Hps06257与HbpB及其C端片段(HbpB2)进行了融合表达,获得4个重组蛋白rHps06257-HbpB、rHbpBHps06257、rHps06257-HbpB2和rHbpB2-Hps06257。采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化该4个重组蛋白后,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达及纯化效果。采用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定这4个串联重组蛋白以及实验室前期保存的两个重组蛋白(rHps06257和rHbpB)的浓度后,分别与ISA201佐剂混合制成亚单位疫苗,对小鼠经皮下注射方式免疫2次,分别在小鼠免疫前、首免后21 d和二免后14 d采血,采用间接ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平;二免后15 d分别以5 LD50(8.40×10^(8)cfu)和10 LD50(1.68×10^(9)cfu)的GPS 5型H5L3株菌液对小鼠经腹腔攻毒,统计各重组蛋白疫苗对小鼠的攻毒保护率。SDS-PAGE检测结果显示,4个重组蛋白分别在约92.4 ku、92.5 ku、63.6 ku和63.6 ku处出现目的条带,均以包涵体形式表达,其表达量占菌体总蛋白的11.2%~28.3%。4个重组蛋白的纯化效果均较好,浓度介于1.2 mg/mL~3.0 mg/mL。Western blot结果显示,4个重组蛋白均能够与GPS阳性血清发生特异性反应。ELISA结果显示,各重组蛋白疫苗免疫组小鼠血清中IgG抗体水平随免疫次数的增加而升高,且均与PBS对照组差异极显著(P<0.01),其中rHps06257-HbpB组小鼠血清中的IgG抗体水平最高。攻毒试验结果显示,采用5 LD50H5L3株攻毒后,重组蛋白疫苗rHps06257-HbpB、rHbpB-Hps06257、rHps06257-HbpB2和rHbpB2-Hps06257对小鼠的免疫保护率均为100%(6/6),重组蛋白疫苗rHps06257和rHbpB对小鼠的免疫保护率分别为67%(4/6)和50%(3/6)(对照组存活率为0);采用10 LD50H5L3株攻毒后,6个重组蛋白疫苗对小鼠的免疫保护率分别为83%(5/6)、0、67%(4/6)、33%(3/6)、0和0。本研究对GPS重要保护性抗原Hps06257与HbpB及其C端片段(HbpB2)进行了4种�
- 杨金钱董玉岗丁略烜史琳琪杨梦娟张俊峰关丽君司丽芳司丽芳薛云
- 关键词：小鼠保护效力亚单位疫苗
- 减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究
- 为开发适用于猪的能够稳定携带外源基因的口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并进一步研究其生物学特性。P...
- 尚珂张俊峰程相朝张春杰李银聚吴庭才余祖华赵战勤丁轲陈桂华
- 文献传递
- 减毒猪霍乱沙门菌△crp△cya△asdC78-1(pYA3493)宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究
- 为开发应用于猪的稳定携带异源基因的口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△crp△cyaC78-1的基础上,运用自杀性质粒pREasd介导的细菌同源重组技术,构建缺失株△crp△cya△asdC78-1,再将携带asd...
- 尚珂张俊峰程相朝张春杰李银聚余祖华丁轲颜云飞陈桂华金修哲赵战勤
- 文献传递
- 副猪格拉瑟菌的荚膜分型方法及原理研究进展
- 2024年
- 副猪格拉瑟菌(GPS)是猪的重要病原菌之一,自1910年被确认为猪格拉瑟病的病原以来,血清型鉴定是GPS研究领域长期以来的“卡脖子”环节。1992年,基于GPS热稳定抗原的凝胶免疫扩散试验(GID)分型方法首次将GPS分为1-15型,但有约25%的菌株不可分型,当时对于其分型抗原的成分也不明确。2003年,基于GPS的“盐水提取物”抗原建立了GPS的间接血凝试验(IHA)分型方法,其敏感性和分型率均高于GID,但仍有约15%的菌株不可分型。IHA和GID方法的分型结果基本一致,因此能够确定两者的分型抗原是基于相同的GPS表面多糖成分,但仍不能确定是荚膜多糖,或是LPS,甚或是其他多糖物质。2013年,1-15型GPS荚膜多糖的合成基因簇得到成功解析,证实其血清型抗原形成的本质是荚膜多糖。2015年,Howell等基于GPS荚膜的特异性靶基因设计引物,建立了GPS的PCR分型方法(H-PCR),但不能对血清5型和12型进行鉴别;2017年,Jia等基于GPS荚膜的特异性靶基因也建立了一套PCR分型方法(J-PCR),能对血清5型和12型进行了鉴别。两种PCR分型方法配合使用可对几乎所有GPS菌株分型,并从分子生物学基础上验证了其与GID和IHA方法的一致性,最终确认三种分型方法的抗原基础均为GPS荚膜。PCR分型方法具有操作简单、速度快、成本低等优点,成功解决了GID和IHA血清分型方法中的诸多问题,得到了广泛应用。本文系统回顾了GPS GID、IHA和PCR分型方法的建立与应用历史,及其相同抗原基础的发现历程,以期为GPS三种分型方法的免疫学物质基础及原理提供系统的理论知识,为副猪格拉瑟菌病防控技术的研发提供新思路。
- 朱亚新关丽君张俊峰薛云赵战勤
- 关键词：荚膜血清型
- 表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1构建及生物学特性
- 为了构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSV GP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株,通过PCR 克隆去除信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3493 中,构建了重组质粒pYA34...
- 张淼丹张明亮张春杰程相朝李银聚张俊峰何雷龙塔
- 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征疫苗载体猪霍乱沙门氏菌生物学特性
- 文献传递
- 表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1构建及生物学特性
- 为了构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSV GP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株,通过PCR克隆去除信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3493中,构建了重组质粒pYA3493...
- 张淼丹张明亮张春杰张俊峰贾艳艳何雷程相朝
- 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因工程疫苗生物学特性猪霍乱沙门菌
- 文献传递
