于长明
- 作品数：100 被引量：255H指数：9
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家杰出青年科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学自然科学总论更多>>
- 人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选被引量：12
- 2000年
- 目的 构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法 用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论 成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。
- 杜桂鑫于长明毛春生王海涛
- 关键词：噬菌体抗体库
- 人源基因工程抗体技术的进展与展望被引量：1
- 1999年
- 鼠源抗体对人的异源免疫原性问题直接导致了人源抗体技术的出现,经过十几年的研究,该技术日臻成熟.嵌合和人源化抗体的研究巳经取得了很大的成功,巳有产品应用于临床,但在实践中有其局限性.噬菌体抗体库体系的创建,用细菌克隆代替B细胞克隆,是人源抗体技术又一次突破性进展.噬菌体抗体操作简便,可以从中筛选出包括中和抗体、毒素抗体、多糖抗体、自身抗体、抗全细胞抗体在内的各种高亲和力抗体.转基因动物抗体技术于叨年代初出现,技术还不大成熟,目前人们只能将一部分人的Ig全套胚系基因转移到动物体内,但发展前景不可限量.
- 毛春生于长明
- 关键词：人源抗体噬菌体文库人源化抗体基因工程
- 破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中的高效表达及应用
- 本发明涉及一种通过核苷酸序列优化使破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中获得高效可溶性表达的方法。根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株CMCC64008株的测序结果，对破伤风毒素受体结合区Hc序列进行分析优化，优化后的...
- 陈薇于蕊侯利华于长明刘树玲任军房婷
- 通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养被引量：5
- 2004年
- 哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。
- 来大志翁少洁齐连权于长明付玲于婷陈薇
- 金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白在大肠杆菌中的表达及应用
- 本发明涉及在大肠杆菌中高效表达金黄色葡萄球菌截短的SasA(Serine-rich adhesion forplatelets)蛋白的方法。根据GenBank报导的金黄色葡萄球菌SasA基因全长序列(GenBank：BX...
- 陈薇易绍琼于长明徐俊杰侯利华付玲任军于婷
- 文献传递
- 复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析被引量：6
- 2004年
- 目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因 ,克隆至分泌型酵母表达载体pMEX9K ,线性化后转化毕赤酵母GS115 ,筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换 ,疏水层析 ,凝胶过滤三步层析纯化 ,用细胞病变抑制法测定其活性 ,并结合lowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS PAGE分析显示 ,重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中 ,经纯化后纯度达到 96 % ,其N端氨基酸序列与理论值一致 ,比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达 。
- 于长明齐连权来大志张晓鹏孔毅荣于婷付玲陈薇
- 关键词：毕赤酵母基因表达
- 适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建被引量：4
- 2004年
- 应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf_1、Vitronectin和Bcl_2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI_NII_IVB。将该载体转染于CHO_dhfr- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO_IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 。
- 翁少洁来大志齐连权于长明付玲陈薇
- 关键词：CHO细胞细胞工程无血清培养基
- RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达被引量：12
- 2005年
- 目的:通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达,从而部分恢复抑癌基因的表达。方法:采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性。应用体外转录的方法,共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列,并转染人肺癌细胞NCI H157。采用MSP PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析,半定量RT PCR检测DNMT1mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达。结果与结论:5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达,且呈剂量依赖效应。人肺癌细胞NCI H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化,在抑制DNMT1活性后,RASSF1A基因去甲基化而恢复表达。
- 陈日升齐连权于长明付玲于婷陈薇
- 关键词：甲基化RNA干涉RASSF1A
- 人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究被引量：1
- 2006年
- 3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF3a和ORF7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。
- 徐春娥付玲侯丽华翁少洁来大志李健民于婷于长明陈薇
- 关键词：SARS-COV
- 用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体被引量：4
- 2000年
- 目的 :构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体。方法 :将微小RNA病毒内部核糖体进入位点 (IRES) ,亚克隆到质粒载体 pCdhfr1多克隆位点 ,构建了哺乳动物细胞双表达载体 pCdhfr5。 结果 :pCdhfr5具有两处多克隆位点 ,由IRES相连。能同时表达两个外源基因。把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到 pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒 pFN ,经脂质体法转染CHO细胞 ,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株。结论
- 刘国奇陈小密徐静于长明宋宏彬童贻刚王海涛
- 关键词：IRESDHFR哺乳动物细胞
