国家自然科学基金(81170786)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 相关作者：卢大儒怀聪陈红岩孙海燕宋晓更多>>
- 相关机构：复旦大学上海近岸科技有限公司更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市教委科研基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- piggyBac转座子和Tol2转座子介导基因长期表达能力的比较
- 2012年
- 目的比较piggyBac（PB）转座子和Tol2转座子介导基因整合到细胞基因组中并实现长期表达的能力，探索将转座子作为一种研究基因长期表达的工具。方法采用荧光蛋白和分泌型碱性磷酸酶（secretedalkalinephosphatase，SEAP）作为报告基因，利用PB转座子和Tol2转座子在CHO细胞和HEK293T细胞中进行细胞转染实验，在传代前和传代后的不同时间点持续监测报告基因表达量的变化情况。结果与不加转座酶的对照组相比，瞬时转染CHO细胞和HEK293T细胞后，PB转座子和Tol2转座子能促进携带的荧光蛋白和SEAP报告基因的表达，并且能够长期表达，PB转座子介导报告基因长期表达的效果优于T012转座子。结论PB转座子介导基因长期表达的能力强于Tol2转座子，PB转座子更适于研究基因的长期表达。
- 李国保卢大儒
- 关键词：PIGGYBAC转座子
- Pklr基因敲除小鼠的构建及其糖脂代谢研究被引量：1
- 2017年
- 目的 丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）作为糖酵解途径的关键限速酶之一,主要在肝脏和红细胞中表达,在糖脂代谢过程中发挥着重要作用.对于PK的研究目前主要集中在细胞实验与临床观察水平,动物模型的缺乏限制了对其进一步研究.因此该研究目的在于建立Pklr基因缺陷小鼠模型,并探索该酶在机体中与糖脂代谢的关系.方法 本研究利用CRISPR/Cas9系统,设计引物sgRNA1与sgRNA2,分别靶向LPK外显子1和共用外显子3.通过测序、实时定量PCR、Western印迹及PK活性测定试剂盒检测小鼠Pklr基因在转录、蛋白质和酶活性等不同层面上的变化,之后通过正常与高脂饮食,检测小鼠体重、白色脂肪及脾脏变化验证PK与糖脂代谢的关系.结果 经过检测发现,小鼠Pklr基因双位点发生基因编辑,与野生型小鼠相比,转录水平下降至24％,LPK蛋白几乎不表达,酶活性下降至33％,在基因、转录、蛋白质和酶活性不同层面上证明成功获得了Pklr基因缺陷小鼠模型,并且发现该基因突变纯合子小鼠在高脂饮食条件下显示出体重下降和白色脂肪积累（P值分别为0.0040、0.0200）,同时两种饮食条件下脾脏重量都显著上升（P =0.0003）.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Pklr基因缺陷小鼠,并且该基因缺陷会导致异常的糖脂代谢.Pklr基因敲除小鼠模型为进一步探索PK在机体内调控机制与糖脂代谢的关系提供了平台.
- 郑成德怀聪周芳芳陈红岩孙瑞林费俭卢大儒
- 关键词：基因缺陷炎症反应糖脂代谢
- 一种由耐热连接酶及单链helper介导的高效DNA定向连接方法
- 将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研究中非常基础且重要的一步。在启动子和外显子功能研究、蛋白质功能研究以及基因操作等传统领域中DNA连接技术都有广泛的应用。而在合成生物学这门新兴学科中,DNA连接更是成...
- 周翔达宋晓怀聪孙海燕陈红岩卢大儒
- 关键词：HELPER
- 耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用被引量：2
- 2016年
- 传统的DNA重组方法 TypeⅡ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction,TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板——Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。
- 周翔达宋晓怀聪孙海燕陈红岩卢大儒
- 关键词：HELPER
- 一种新型重组人源性白细胞介素-8活性检测方法的建立
- 2013年
- 目的通过蛋白质片段互补检测（proteinfragmentcomplementationassay，PCA）技术检测重组人源性IL-8的生物学活性。方法利用PCA方法构建了Split—TEVGPCR激活检测系统，为了验证其有效性，在不同的宿主系统中表达和纯化了各种亚型的人源性IL-8重组蛋白用于进行活性检测。蛋白样品包括：①IL-8亚型I（残基21-99），通过在哺乳动物细胞HEK293中分泌表达前体IL-8基因获得，其N端信号肽（残基1—20）被切除；②IL-8亚型Ⅱ（残基23—99）和亚型Ⅲ（残基28—99），通过在大肠杆菌BL21（DE3）中表达获得。结果Split—TEVGPCR激活检测系统证明纯化后的重组人源性IL．8样品对天然受体IL8RB都具有明显的激活活性，其EC50值分别为：12．32±0．89ng／mL（亚型I）、15．14±1．84ng／mL（亚型Ⅱ）和2．854-0．50ng／mL（亚型Ⅲ）。结论成功建立了-种新型的重组人IL-8活性检测方法，为进一步的理论研究和IL-8中和抗体的高通量筛选奠定了基础。
- 王英明陈帅张清仪李德彬闫林慧廖远平王丁力卢大儒朱化星
- 关键词：活性检测
- 利用TALEN系统快速构建MSTN突变小鼠模型
- 引言：肌肉生长抑制素Myostatin基因(MSTN,也叫GDF8)是一种抑制骨骼肌生长发育的生长因子,为TGF-β超家族成员.其不仅在骨骼肌中表达,在肝脏,乳腺组织,脂肪组织等器官也有少量存在.现已有研究表明MSTN参...
- 周芳芳姜坤林玥琳陈红岩费俭卢大儒
- 关键词：MSTNTALENHRM
