国家自然科学基金(30730093)
- 作品数：11 被引量：19H指数：3
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- 相关机构：第三军医大学西南医院第三军医大学创伤烧伤与复合伤国家重点实验室更多>>
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- CASK下调表达对人血管内皮细胞ECV-304增殖能力的影响
- 2009年
- 目的建立CASK下调表达细胞株,研究钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium,calmodulin-associated serine/threonine kinase,CASK)下调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响。方法将包含针对CASK基因干扰siRNA片段的pGenesil-1-hCASK重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出CASK下调表达的细胞株。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中CASK基因的表达水平。采用流式细胞技术、MTT法观察CASK下调表达对ECV-304细胞增殖能力的变化。结果成功筛选出CASK下调表达ECV-304细胞株(siCASK细胞株),这些细胞在传代过程中绿色荧光蛋白能维持表达,细胞株中转染阳性率在90%以上;经蛋白免疫印迹法检测CASK表达明显降低;siCASK细胞株中G0/G1细胞比率下降,G2M期细胞比率明显上升,增殖指数明显提高,生长曲线左移。结论成功建立了CASK下调表达的ECV-304细胞株,CASK下调表达可导致细胞增殖能力增强。
- 陈建苏踊跃梁光萍陈渝罗向东杨宗城
- 关键词：RNA干扰细胞增殖
- 基底刚度对成纤维细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2011年
- 目的 了解基底刚度对FH增殖、迁移和整合素β1表达的影响。方法将Fb接种于刚度为（16．2±0．5）、（19．8±1．1）、（200．1±2．6）kPa的硅胶基底上，进行如下检测（1）分别连续培养5d或6d，进行细胞计数、噻唑蓝法检测细胞增殖活性（吸光度值表示）。（2）培养3d，检测细胞周期，计算增殖指数（PI）。（3）划痕实验后培养0（!_日）、1、2、3d，测定Fb迂移牢。（4）培养2d，流式荧光法检测细胞中整合素β1表达．对部分数据进行译因索方籍分析.结果（1）细胞计数、嚷唑蓝法榆测均显示，h增殖速度及活性均随着硅胶琏底刚度的增强而增加。细胞周期检测显永：存刚度为（16．2±0．5）、（19．8±1．1）、（200．1±2．6）kPa的硅胶琏底上，细胞的P1分别为24．8％、27．4％、32．4％。（2）培养2d，在刚度分别为（19．8±1．1）、（200．1±2．6）kPa的硅胶蔡底表面上，Fh迁移率分别为（91．4±5．1）％、（100．0±1．3）％，均明漫高于刚度为（16.2±0．5）kPa硅胶基底表面的F11迁移率[（55．8±6．8）％，F值分别为3．5、4．0，P值均小于0．01]。（3）刚度为（16．2±0．5）kPa硅胶基底表面的Fh中整合素β1，表达牢最低，仅43．2％．冈0度为（200．1±2．6）kPa硅胶尽底表两的Fb中整合素13．表达率最高（81．3％）。结论基底刚度对Fb在创两愈合和搬痕形成过程中的增殖、迁移有较大影响，这一效应与其调控Fb枢合素β1表达作用相关。
- 王玉王贵学罗向东邱菊辉
- 关键词：成纤维细胞细胞运动抗原CD29刚度
- 重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探被引量：3
- 2009年
- 目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性。方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5mmol/L IPTG诱导表达4h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性差异。结果GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉西林和环丙沙星。结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景。
- 甘晓琴伍素华罗向东杨成吴燕
- 关键词：抗菌肽铜绿假单胞菌
- 富组蛋白1促进人成纤维细胞增殖和迁移被引量：1
- 2012年
- 目的了解富组蛋白1(histatin1,Hst1)对人成纤维细胞增殖和迁移功能的影响。方法将人成纤维细胞按常规方法传代培养,分为空白对照组(DMEM+1%小牛血清)、A组(100μg/ml Hst1)、B组(30μg/ml Hst1)、C组(3μg/mlHst1),细胞计数法观察不同浓度Hst1(3～100μg/ml)在不同时相点(24、48、72 h)对人成纤维细胞增殖功能的影响;将已融合的人成纤维细胞分为丝裂霉素C处理组及丝裂霉素C未处理组,各组中再次分为空白对照组(DMEM+1%小牛血清)、Ⅰ组(30μg/ml Hst1)、Ⅱ组(10 ng/ml rhEGF)、Ⅲ组(30μg/ml Hst1+10 ng/ml rhEGF)、Ⅳ组(15μg/ml Hst1+5 ng/mlrhEGF)、Ⅴ组(15μg/ml Hst1+10 ng/ml rhEGF),通过体外细胞划痕实验考察Hst1对人成纤维细胞迁移功能的影响。结果①不同浓度的Hst1能够促进人成纤维细胞增殖,与浓度及时间无明显依赖关系,24 h时间点A、B组细胞数显著高于其余各组(P<0.01);②30μg/ml Hst1能促进细胞划痕创面愈合,8 h划痕愈合率约37.7%,与rhEGF联合应用时促划痕愈合率高于单独用药;利用丝裂霉素C排除细胞增殖作用后,30μg/ml Hst1较空白对照组无促进细胞迁移功能(P>0.05),划痕愈合率较丝裂霉素C未处理对应组下降,但无统计学意义,且与rhEGF联合应用时促划痕愈合率与单独用药无统计学差异(P>0.05)。结论 Hst1能够促进人成纤维细胞增殖,但促迁移功能不明显。Hst1联合rhEGF使用时对人成纤维细胞划痕创伤愈合具有协同促进作用。
- 蒋艳王仙园罗向东
- 关键词：人成纤维细胞细胞增殖细胞迁移创伤
- 钙对HaCaT细胞整合素β1启动子活性和表达及细胞迁移的影响被引量：1
- 2010年
- 目的 了解钙离子对人永生化KC株HaCaT细胞整合素β1启动子活性、蛋白表达及细胞迁移的影响.方法 （1）体外培养HaCaT细胞（12孔板）,按随机数字表法分为5组,每组18孔.分别用pGL3启动子（阳性对照组）、pGL3空载体（阴性对照组）及pGL3-1756 bp（全长启动子组）、pGL3-1442 bp（远端启动子组）、pGL3-261 bp（近端启动子组）报告质粒转染HaCaT细胞,转染分别在含0.00、0.03、0.09、0.30、0.80、1.20 mmol/L钙离子的无血清RPMI 1640培养液中进行（每组每种浓度3孔）.24 h后用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对活性.（2）取本室构建的稳定转染小干扰RNA-整合素β1载体（简称稳定转染）的HaCaT细胞,常规培养后按随机数字表法将细胞分为6部分,用前述6种浓度钙离子处理,每种浓度3个样本.采用蛋白质印迹法检测整合素β1蛋白表达水平.（3）于6孔板中培养正常HaCaT细胞和稳定转染的HaCaT细胞,每种细胞18孔.按常规进行划痕处理后,用含前述6种浓度钙离子的培养液（按随机数字表法划分.每种浓度3孔细胞）培养12 h.观察并检测细胞迁移率.（4）对各实验结果进行单因素方差分析和独立样本t检验.结果 （1）全长启动子组细胞在钙离子浓度由0.00 mmol/L升至0.09、0.30 mmol/L时,荧光素酶相对活性由0.16±0.09升至0.39±0.09、0.35±0.05（t值分别为3.143、3.140,P值均小于0.05）;当钙离子浓度升至0.80、1.20 mmol/L时,荧光素酶活性下降.远端启动子组细胞荧光素酶相对活性随钙离子浓度变化的趋势与全长启动子组相似,但在0.09、0.30 mmol/L时,该酶活性分别为0.56±0.32和0.64±0.06,明显高于全长启动子组（t值分别为0.887、6.122,P值均小于0.05）.各种浓度钙离子对近端启动子组荧光素酶相对活性无明显影响.（2）当钙离子浓度为0.00 mmol/L时,稳定转染的HaCaT细胞整合素β1蛋白表达量为0.53±0.10.当钙离子浓度为
- 杜广刚罗向东邱菊辉张琳琳
- 关键词：钙细胞运动转录启动子HACAT细胞
- Id1强制表达对血管内皮细胞株ECV-304增殖能力的影响
- 2009年
- [目的]为深入研究hCASK功能,构建Id1真核表达载体并转染ECV-304细胞,筛选出Id1强制表达细胞株,观察Id1上调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响。[方法]采用RT-PCR方法获取编码Id1的cDNA序列,并将其导入真核表达载体成功构建pIRES2–EGFP-Id1重组表达质粒。将重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出Id1强制表达的细胞株。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中Id1基因的表达水平。采用流式细胞技术、细胞计数的方法观察筛选出的细胞株增殖能力的变化。[结果]成功建立了Id1强制表达的ECV-304细胞株。同未转染细胞相比,Id1强制表达细胞株中G0/G1细胞比率下降约4.8%,G2M期细胞比率上升约26.3%,增殖指数明显增高,细胞增殖能力增强。[结论]Id1强制表达细胞株的成功建立和鉴定为CASK、Id1基因功能研究提供了有效手段,Id1的上调表达可导致ECV-304细胞增殖能力增强。
- 陈建梁光萍罗向东杨宗城
- 关键词：ID1CASK细胞增殖
- 富组蛋白1对人表皮细胞株HaCaT增殖和迁移功能的影响被引量：1
- 2012年
- 目的了解富组蛋白1（Hstl）对人表皮细胞株HaCaT增殖、迁移功能的影响方法（1）常规培养HaCaT细胞，按照随机数字表法（分组方法下同）分为对照组与100、30、3g／mLHsll纰以及10ng／ml。重组人表皮生长因子（rhEGF）组、30μg／mLHstl＋10ng／mLrhEGF组，每组样小数为27。对照组不添加刺激因素,后5组分别加入相应浓度Hstl和（或）rhEGF，培养24、48、72h采用细胞计数法检测各组细胞增殖水平。（2）将HaCarr细胞分为对照组与100、30、3μg／mLHstl组。每组样本数为27。对照组不添加刺激因素，后3组分别加入相应浓度Hstl，培养24、48、72h采用流式细胞术检测各组细胞周期，计算增殖指数（PI）。（3）将HaCaT细胞分为对照组、30μg／mLHstl组、10ng／mLrhEGF组、30μg／mLHstl＋10ng／mLrhEGF组、15μg／mLHstl＋5ng／mLrhEGF组、15μg／mLHstl＋10ng／mLrhEGF组，每组样小数为10。对照组不添加刺激因素，后5组分别加入相应浓度的Hstl和（或）rhEGF培养。将各组细胞分为2份，一份用丝裂霭素C处理2h，另一份不作处理,均行划痕实验，划痕后0（即刻）、16、24h观测细胞迁移情况并计t算划痕愈合面积百分比。对数据行方差分析、LSD-t检验或Dunnettt检验。结果（1）培养24h，10ng／mLrhEGF组、30μg／mLHstl＋10ng／mLrhEGF组细胞数显若高于对照组（t值分别为3．813、5．410，P〈0．05或P〈0，01）。与培养48h时30、3μg／mLHstl组比较除外,其余各Hstl和（或）rhEGF对照组培养48、72h细胞数均显著高于对照组（t值为7．754-24．979，P值均小于0．01）。培养72h，100μg／mEHstl组细胞数为（19，21±0．59）×10^4个，明显高于30μg／mLHstl组的（16．19±0．53）×10^4个及3μg／mLHstl组的（15．38±0．13）×10^4个（t值分别为11．391、19．017，P值均小于0．01）；30μg／mLHstl＋10ng／mLrhEGF组细胞数高于30、3μg／mLHstl组及10ng／mlJrhEGF组（t值为4�
- 蒋艳王仙园罗向东
- 关键词：细胞运动HACAT细胞
- 不同基质蛋白对乳腺癌细胞生物学性质及细胞弹性的影响
- <正>l型胶原(Type I collagen,Coll)和纤维连接蛋白(Fibrorectin,FN)是肿瘤组织中两种非常重要的基质蛋白,其在肿瘤组织及肿瘤细胞中的表达会发生一定的变化。本文将MDA-MB231和MCF...
- 滕艳群邱菊辉郑燚明罗向东王贵学张琳琳陈莉
- 关键词：乳腺癌细胞纤维连接蛋白MOA基质蛋白生物学性质
- 文献传递
- 不同构型单链DNA的固有驻留长度
- <正>单链DNA(ssDNA)足某些螺旋状病毒的遗传物质,还能通过带负电核酸与带正电蛋白质间的静电吸引力与蛋白质结合——即单链DNA结合蛋白(SSBP)防止两条互补单链再次结合为双螺旋,维持单链状态。单链DNA还是DNA...
- 池晴佳王贵学
- 关键词：静电相互作用DNA
- 文献传递
- 富组蛋白1促皮肤创伤愈合的细胞学研究被引量：1
- 2012年
- 目的了解富组蛋白1(histatin1,Hst1)对人表皮细胞(human adult skin keratinocytos,HaCaT)、人成纤维细胞株增殖和迁移功能的影响。方法细胞增殖实验:(1)将HaCaT细胞、人成纤维细胞均分为空白对照组(1640/DMEM+1%新生牛血清)、Ⅰ组(100μg/ml Hst1)、Ⅱ组(30μg/ml Hst1)、Ⅲ组(3μg/ml Hst1),比较两种细胞的增殖数量;(2)细胞划痕实验:将两种细胞分为空白对照组(1640+1%新生牛血清)、A组(30μg/ml Hst1)、B组[10ng/ml人重组表皮生长因子(recombinant human epidermalgrowth factor,rhEGF)]、C组(30μg/ml Hst1+10ng/ml rhEGF)、D组(15μg/ml Hst1+5ng/ml rhEGF)、E组(15μg/ml Hst1+10ng/ml rhEGF),比较两种细胞体外创面愈合速度。结果 (1)3～100μg/ml的Hst1能够促进HaCaT增殖,72h时Ⅰ组细胞数高于空白对照组、Ⅱ组及Ⅲ组(P<0.01);3～100μg/ml的Hst1能够促进人成纤维细胞增殖,24h时Ⅰ、Ⅱ组细胞数高于其余各组(P<0.01);(2)30μg/ml Hst1能促进HaCaT细胞迁移,16h时A组划痕愈合率高于空白对照组(P<0.01),C、D组高于A组(P<0.05);30μg/ml Hst1能促进人成纤维细胞划痕创面愈合,与rhEGF联合应用时划痕愈合率高于单独用药。结论 Hst1能够促进HaCaT细胞和人成纤维细胞增殖和迁移,与rhEGF联合应用时对其促进体外创伤愈合具有协同作用。
- 蒋艳王仙园罗向东周娟
- 关键词：HACAT细胞人成纤维细胞细胞迁移创伤
