国家自然科学基金(20206014)
- 作品数：13 被引量：54H指数：4
- 相关作者：沈忠耀于慧敏史悦孙旭东罗晖更多>>
- 相关机构：清华大学北京科技大学北京化工大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金更多>>
- 相关领域：化学工程生物学轻工技术与工程理学更多>>
- 诺卡氏菌腈水合酶基因在重组毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2005年
- 为从基因水平上改造腈水合酶,进行了诺卡氏菌腈水合酶基因的外源表达研究。在重组大肠杆菌表达系统内,腈水合酶的α亚基几乎不能正常表达,在重组E.coliBL21(DE3)(pET32aNHBAX)中,腈水合酶活性仅为0.04Umg。构建重组毕赤酵母表达质粒pPIC3.5kNHBAX,采用电穿孔转化法将其转入宿主菌P.pastorisGS115中,经过菌株培养和腈水合酶的诱导表达,筛选获得了优选菌株P.pastorisNH4。对P.pastorisNH4的细胞培养和腈水合酶的诱导表达条件进行优化,结果表明,重组腈水合酶在毕赤酵母中的表达水平可以达到0.52Umg,但不能稳定积累。
- 于慧敏史悦田卓玲温斐沈忠耀
- 关键词：诺卡氏菌腈水合酶大肠杆菌毕赤酵母
- 六级连续化膜生物反应工艺在丙烯酰胺生产中的应用研究被引量：1
- 2006年
- 以自由细胞替代固定化细胞,成功设计了六级连续化中空纤维膜生物反应器新工艺,应用于丙烯酰胺的微生物转化过程,并对其操作工艺和可行性进行了研究。结果表明:在15℃下,该六级连续化过程稳定运行80 h时,丙烯腈的转化率达99.9%以上,丙烯酰胺产物浓度达434.23 g/L,生产效率达到0.01526 mol/(L.min),生产效率比固定化细胞批式反应提高了一倍以上,产品溶液浓度提高50%以上。中空纤维膜可以使反应液和菌体得到有效的分离,且在反应液中没有检测到副产物丙烯酸。新工艺实现了丙烯酰胺的稳定连续化生产。
- 孙旭东于慧敏罗晖沈忠耀
- 关键词：丙烯酰胺中空纤维膜生物反应器
- 诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达被引量：2
- 2007年
- 为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。
- 史悦于慧敏罗晖田卓玲沈忠耀
- 关键词：腈水合酶重组大肠杆菌重组毕赤酵母定点突变
- 气相色谱法快速定量检测丙烯腈的生物催化产物被引量：8
- 2007年
- 利用微生物催化丙烯腈生产丙烯酰胺在工业上已经得到了广泛的应用。生产中反应液同时含有底物丙烯腈、产物丙烯酰胺以及副产物丙烯酸。为了控制产品质量,需快速定量检测反应液中各组分。采用毛细管柱PEG-20M(30 m×0.25 mm i.d.,2μm),以20 g/L的乙酰胺作为内标物对反应液进行气相色谱分析,优化分析条件为:进样口为SPL,温度260℃;FID检测器,温度260℃;柱温190℃;载气为氮气,流速25 cm/min;分流进样,进样量0.4μL,分流比为50∶1。在4 min内,3个组分得到完全分离,该方法具有良好的重现性和线性关系,回收率分别为98.5%、102.1%、105.0%,相对标准偏差分别为9.1%、5.3%、1.7%。该方法分析速度快,适合实验室与工厂生产中大量快速定量检测样品。
- 王铁钢罗晖朱燕勤于慧敏杨慧芬沈忠耀
- 关键词：气相色谱法快速定量检测丙烯腈丙烯酸丙烯酰胺
- 六级连续化膜生物反应工艺在丙烯酰胺生产中的应用研究
- 在丙烯酰胺微生物转化的工业化应用中,基本上采用了固定化细胞的方法,一般采取简单的批式反应方式。固定化细胞催化工艺存在着不少问题,如酶活力损失严重、工艺过程复杂及后处理要求高等。许多研究者已经开始着眼于用游离细胞代替固定化...
- 孙旭东于慧敏史悦沈忠耀
- 关键词：丙烯酰胺微生物转化
- 文献传递
- 诺卡氏菌腈水合酶基因在重组大肠杆菌中的活性表达
- 腈水合酶(NHase)以其温和的反应条件、高选择性和高效性,在酰胺、羧酸及其衍生物的合成中具有重要的应用价值。一株工业上应用于生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺的诺卡氏菌株(Nocardia sp.)显示出了高水平的酶活性,发酵...
- 史悦于慧敏赵晖田卓玲沈忠耀
- 关键词：水合酶重组大肠杆菌活性表达
- 文献传递
- 产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究被引量：16
- 2005年
- 成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。
- 史悦于慧敏田卓玲沈忠耀
- 关键词：腈水合酶质粒稳定性质粒拷贝数重组大肠杆菌琼脂糖凝胶电泳重组菌株
- 诺卡氏菌腈水合酶的催化反应机理探索
- 微生物腈代谢酶系中腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用。确切地了解腈水合酶催化反应机理对于基因工程改造腈水合酶产生菌具有很强的指导意义。一株工业上应用于生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺的诺卡氏菌株(Nocardia s...
- 田卓玲史悦于慧敏沈忠耀
- 关键词：催化反应机理水合酶定点突变
- 文献传递
- 聚砜中空纤维膜在丙烯酰胺微生物转化中的应用基础研究被引量：4
- 2004年
- 将聚砜为材料的中空纤维膜组件应用于丙烯腈水合转化为丙烯酰胺的微生物转化和膜分离耦合过程,对其特性进行了初步研究.结果表明:该膜对此反应体系有很好的适用性,通过中空纤维膜使反应液和菌体得到有效的分离,实现了膜分离耦合的酶催化反应过程.20℃时,在不更新菌液的情况下,持续操作5h,丙烯腈转化率达到99%,发酵菌液可催化合成丙烯酰胺2.722g/(mL·h),产物中没有检测到副产物丙烯酸.膜材料的应用研究为长期连续化生产过程的研究打下了基础.该工艺过程以自由细胞替代固定化细胞,实现了连续化操作,具有良好的工业应用前景.
- 孙旭东史悦沈忠耀
- 关键词：聚砜中空纤维膜丙烯酰胺微生物转化膜反应器截留性能
- 诺卡氏菌酰胺酶基因的分子克隆及在大肠杆菌中表达的初步研究被引量：1
- 2006年
- 酰胺酶是一种重要的工业酶。利用生物信息学手段,在和已知酰胺酶基因序列分析比对的基础上,首次从Ncordiasp.YS-2002中成功地克隆得到酰胺酶基因ami,并对其基因序列及氨基酸序列的性质进行了分析。结果表明,所得酰胺酶基因ami片段大小共为1446bp,由启动子区、阅读框和回文结构终止区三部分构成。序列分析和进化树分析表明,Ncordiasp.YS-2002酰胺酶是一种比较特殊的酰胺酶,不含大多数酰胺酶共同具有的保守区序列。进一步将酰胺酶基因连接到pET-28a(+)上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中筛选获得重组菌株PEAB。酶活测定结果表明重组菌具有酰胺酶酶活,但较低,其原因可能是因为大量表达的产物主要以包涵体的形式存在。
- 许幂于慧敏谭天伟朱燕勤沈忠耀
- 关键词：诺卡氏菌分子克隆
