目的:构建慢病毒转染的肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)高表达体系,并建立稳定、高效、长久高表达FTO的人永生化膀胱移行上皮SV-HUC-1稳定细胞株,为研究FTO基因在膀胱癌发生及进展中的作用打下基础。方法:从SV-HUC-1细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA。以cDNA为模板应用PCR技术扩增FTO编码基因,将其连接入PLEX-puro表达载体(PLEX-puro-FTO),并转化至感受态大肠杆菌JM109中。对氨苄青霉素和博来霉素双重筛选的阳性克隆进行测序,鉴定插入正确后抽提质粒,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SV-HUC-1细胞,48小时后加入终浓度1μg/ml的嘌呤霉素进行药物筛选,10天后得到稳定细胞株,用Western blot测定转染后SV-HUC-1细胞中FTO蛋白的表达水平。结果:测序结果证实目的片断正确插入PLEX表达载体中,成功构建了PLEX-puro-FTO高表达载体;稳定转染高表达载体SV-HUC-1细胞的FTO蛋白表达显著高于转染空载体细胞。结论:成功构建了PLEX-puroFTO重组慢病毒质粒,并获得FTO蛋白高表达的SV-HUC-1稳定细胞株。
